体内药物分析概述

体内药物分析概述第1页/共64页乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：口服。成人常用量：支气管感染、肺部感染：一次2片，一日2次，或一次1片，一日3次，疗程7-14日。急性单纯性下尿路感染：一次1片，一日2次，疗程5～7日；复杂性尿路感染：一次2片，一日2次，或一次1片，一日3次，疗程10～14日。细菌性前列腺炎：一次2片，一日2次，疗程6周。0.3-0.4g/日0.2g/日0.4g/日第2页/共64页抗菌药物的抗菌活性药物抑制或者杀灭病原菌的能力最低抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration）抑制培养基内细菌生长的最低浓度。MIC最低杀菌浓度（minimumbactericidalconcentration）杀灭培养基内99.9%的微生物。MBC喹诺酮类药物对致病菌的杀菌作用取决于药物血药浓度的峰浓度，即药物浓度越高，杀菌作用越强。——浓度依赖性时间依赖性——杀菌活性与药物浓度维持在MIC以上时间的长短有关。β-内酰胺类、林可霉素类等抗生素。第3页/共64页乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：口服。成人常用量：支气管感染、肺部感染：

药物随着血液到各个组织急性单纯性下尿路感染：

药物通过尿液排泄在下尿路发挥治疗作用细菌性前列腺炎：

药物随着血液到前列腺组织0.3-0.4g/日0.2g/日0.4g/日测定血液、尿液甚至组织中的药物浓度第4页/共64页1.1体内药物分析的定义体内样品（生物体液、器官或组织）中药物及其代谢产物或内源性生物活性物质的定性、定量分析。体内样品——确定分析对象药物、代谢产物、内源性生物活性物质——确定待分析物定性、定量分析——如何选择分析手段、建立方法并验证1.概述第5页/共64页体内·药物·分析原料药纯度高

干扰少容量分析为主制剂主药一或多

辅料干扰多仪器分析为主体内药物成分复杂

干扰众多

浓度很低高灵敏度

高选择性的方法第6页/共64页1.2体内药物分析对象和待测物特点★成分复杂、干扰众多生物基质的干扰——蛋白质、糖、脂肪、离子……其他药物的干扰——卡马西平治疗癫痫的有效血药浓度为3~8μg/ml，潜在中毒浓度为12μg/ml。病人可能之前用过其他抗癫痫药物如丙戊酸钠、乙琥胺等。代谢产物与原型药物互相干扰——抗抑郁药米氮平DMR8-OHMN-O-MRT方法选择性要高第7页/共64页体内药物分析对象和待测物特点★采样量小，浓度很低常见的生物样品采样量少，特定条件采集，不易重新获得

血浆：人1~3ml；犬1~5ml；大鼠0.3~0.5ml浓度为ng/ml~µg/ml数量级血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液等均匀生物样品心、肝、脾、肺、肾、脑等非均匀生物样品方法灵敏度要高第8页/共64页1.3体内药物分析方法的特点★对分析方法的要求高：满足灵敏度及专属性的要求样品需要经过前处理，才能分析分析工作量大，方法验证要求严格，测试数据处理和结果阐明较为复杂1.概述第9页/共64页1.4体内药物分析的任务定性分析——药物代谢产物、内源性物质是什么定量分析——血浆、组织、尿液药物及代谢物浓度药物代谢与动力学（drugmetabolismandpharmacokinetics，DMPK）研究——新药研发治疗药物监测（TherapeuticDrugMonitoring，TDM）——临床应用内源性物质检测——疾病标志物社会事件中的分析——食品安全、法医毒物分析等1.概述第10页/共64页体内药物分析的任务：DMPK药代动力学研究涉及药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄等动态过程，需要研究血药/组织浓度－时间曲线的变化，探讨药物分布与药理作用的关系。1,2–Stability+Solubility3–Passive+ActiveTrans.4–Pgpefflux+CYP3A45-Hepaticfirstpasseffect第11页/共64页药物代谢与动力学血药浓度-时间曲线尿药累积排泄曲线生物等效性评价绝对生物利用度相对生物利用度代谢途径代谢酶……第12页/共64页体内药物分析的任务：TDMTDM即测定血液中或其它体液中药物浓度，观察临床药物反应，考察药物治疗效果，必要时根据药动学原理调整给药方案。方向是实现个体化给药，目的为临床合理用药服务，达到最佳的药物治疗效果。治疗范围中毒范围无效范围C最大耐受浓度最小有效浓度第13页/共64页治疗药物监测血药浓度μg/ml10~2020~3030~40>40药理及

毒性反应有效血药浓度眼球震颤运动失调精神异常抗癫痫药苯妥英钠血药浓度与药理作用及毒性反应患者女性，25岁，因癫痫强直阵挛性发作入院，遂静脉注射负荷剂量苯妥英钠800mg并开始口服维持剂量250mg/d。测得苯妥英钠的浓度为3.6μg/ml，医生考虑到尚未达到治疗浓度范围，故增加剂量到400mg/d。患者出现痉挛等类似癫痫发作症状。测得血药浓度为10.9μg/ml，医生拟打算再次增加剂量。患者白蛋白为20g/L(正常范围是34~48g/L)，于是建议检查患者游离苯妥英钠浓度。结果显示游离苯妥英钠浓度为4.9μg/ml（游离药物治疗浓度范围1~2μg/ml），判定患者苯妥英钠中毒，建议降低剂量为250mg/d。第14页/共64页体内药物分析的任务：内源性物质检测体内内源性物质如氨基酸、激素、儿茶酚胺、肌酐、草酸、尿酸等。机体正常生理条件或机体发生病变：测定体内内源性物质或疾病标志物的含量，疾病的辅助诊断或及早预防。药物（中药）代谢组学研究第15页/共64页体内药物分析的中心任务体内药物分析方法学研究生物样品预处理方法分离分析实验条件的优化选择考察体内分析方法的灵敏度、专属性、准确度、线性范围等为临床药理学、临床药学等相关学科提供专一、灵敏、准确、快速、简便的体内药物分析方法。第16页/共64页2.1体内样品的种类与采集血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液等均匀生物样品心、肝、脾、肺、肾、脑等非均匀生物样品样品选取原则（1）必须是能够反映出浓度与药物效应之间关系；（2）易于获得；（3）便于处理，适合于分析；（4）根据不同目的与要求进行选取。2.体内样品的种类、采集与贮存第17页/共64页体内样品种类与采集血液自然凝结加抗凝剂离心离心全血上层：血清serum（比血浆少纤维蛋白原）（40%）下层：血细胞（凝块）上层：血浆

plasma（50%）下层：血细胞血样Blood一般在给药后的不同时间点采集血样第18页/共64页体内样品种类与采集尿样Urine特点：尿药浓度通常变化较大；尿药大多呈结合状态。优点：易得，且样品量多；正常尿液仅含微量蛋白。缺点：尿液是一种良好的细菌培养基；尿液中多具有紫外吸收的化合物。一般在给药后的不同时间段收集尿样第19页/共64页体内样品种类与采集唾液Saliva优点：非伤害性采样，且不受时间地点限制。缺点1：唾液药浓一般低于血浆药浓；

某些药物的唾液药浓（S）与血浆游离药浓（UP）十分接近，但两者相关系数不明确；

pH改变会影响弱酸性和弱碱性药物在唾液中的药物浓度。一般自然采集或刺激采集，量少第20页/共64页体内样品的种类与采集组织tissue指各种体内脏器，需要对其进行均匀化制备，使之成匀浆溶液反应药物在脏器的分布与蓄积情况头发hair取样方便，可以获得长期的用药史信息前处理复杂，需要排除头发表面的各种干扰第21页/共64页2.2体内样品贮存与处理室温放置时间短期保存温度与时间长期保存温度与时间-20、-40、-80℃分装保存——便于测定去活性保存——防止酶降解保存温度与时间由

什么决定？2.体内样品的种类、采集与贮存第22页/共64页研究维生素C泡腾片进入人体后血药浓度-时间曲线变化，通过测定给药后人血浆中维生素C实现。问：采集血样之后如何保存？维生素C的性质？维生素C容易氧化，因此采集血样后加入抗氧剂保存。第23页/共64页3.1体内药物分析的一般流程

血样尿液唾液胆汁组织器官前处理方法

分离纯化浓集样品测定方法建立方法优化方法学研究灵敏度准确度精密度线性和范围耐用性……灵敏、准确、快速、简便3.体内药物分析方法的建立与评价第24页/共64页新药临床药物代谢动力学评价新药I期临床试验阶段中进行药物在健康志愿者体内药物代谢动力学，探讨药物在体内吸收、分布和消除的特点，为II期临床实验的给药方案制定提供伦理依据。研究内容包括健康受试者单次与多次给药的药物代谢动力学研究、饮食的影响、代谢产物的代谢动力学研究、药物-药物的代谢动力学相互作用研究等。体内药物分析方法是关键第25页/共64页人血浆中普卢利沙星活性代谢产物NM394的检测羧基：酸性基团哌嗪环：碱性、水溶性增加共轭结构第26页/共64页分析方法建立分析待测物——NM394分析目标——建立分析方法可以专属、灵敏、准确的检测出血浆中NM394HPLC法——分离分析选择内标化合物——准确定量选择前处理方法——消除干扰、提高检测浓度第27页/共64页分析方法的建立—色谱条件及优化体外方法的建立色谱柱：DiamonsilC18柱(5µm,200mm×4.6mmi.d.)保护柱：DiamonsilTMODS流动相：乙腈-0.5%三乙胺（磷酸调pH3.0）为21:79流速：1ml/min荧光检测：λex-280nm,λem-425nm柱温：30℃内标化合物为洛美沙星（结构类似、性质相近）第28页/共64页分析方法的建立—样品前处理分析方法的优化必须考虑

生物样品的前处理的影响？第29页/共64页3.2体内分析样品前处理3.2.1生物样品前处理的目的纯化药物，消除干扰净化满足检测灵敏度的要求富集减少对分析仪器的污染改善分析环境除非生物样品基质不会干扰检测，也不会污染仪器，同时还有较好的灵敏度3.体内药物分析方法的建立与评价第30页/共64页示例：血液中酒精的检测（直接测定）顶空气相色谱火焰离子化检测器进行检测0.2ml全血和0.5ml内标放到小瓶后迅速封口小瓶被放到顶空进样器上自动加热获得气液两相平衡将液上气体注入GC分析第31页/共64页3.2.2蛋白沉淀proteinprecipitationPPT★测定血样时用，去除蛋白质，使结合的药物释放出来有机溶剂沉淀法（甲醇、乙腈）中性盐析法（饱和硫酸铵）强酸沉淀法（高氯酸）使蛋白变性后除去第32页/共64页蛋白沉淀过程示意图A B C DA血浆样品200µlB加入甲醇600µlC涡旋混合3min后D10000rpm离心10min后第33页/共64页34沉淀剂每1容积血浆加入沉淀剂容积0.21.02.03.04.0甲醇17.673.498.798.999.2乙腈13.497.299.799.899.810%三氯醋酸99.799.599.899.899.8钨酸盐-硫酸3.399.799.899.9100.0(饱和)硫酸铵21.353.498.3**CuSO4-Na2WO436.597.599.9100.0100.0ZnSO4-NaOH41.194.299.398.899.6常用蛋白沉淀剂的用量及沉淀蛋白的百分率*：样品浑浊，妨碍准确测定第34页/共64页蛋白沉淀应用特点确定沉淀剂与血浆的最佳比例稀释倍数满足检测灵敏度的要求尽可能多沉淀蛋白，减少对仪器的污染适合浓度较高的血样处理过程快速，适合不稳定的药物测定第35页/共64页3.2.3液液萃取liquid-liquidextractionLLE★常选择与水不混溶的有机溶剂，根据药物在水中与有机溶剂中的溶解度不同而将目标药物和干扰物质分开，随后浓缩含有目标药物的有机层体液中内源性物质多为极性成分药物多为亲脂性弱酸或弱碱第36页/共64页液液萃取示意图取1ml血浆

置具塞玻璃离心管中精密加入5ml

乙酸乙酯

提取溶剂充分涡旋混合3min第37页/共64页液液萃取示意图4000rpm

离心10min后准确取出上层有机溶剂置另一干净具塞玻璃离心管置N2下水浴挥干溶剂残留物用流动相溶解离心后进样HPLC分析便于纯化与富集第38页/共64页液液萃取应用特点确定合适的萃取溶剂依据相似相溶原则正己烷→乙醚→乙酸乙酯→正丁醇

极性增大有机相:水相=1:1~5:1第39页/共64页示例：尿液中甲基苯丙胺与苯丙胺的检测（液液萃取）取尿液2ml，置于5ml离心管中，加入5ml乙醚，涡旋，离心，取乙醚层置另一5ml离心管中，60度水浴氮气流下挥干取尿液2ml，置于5ml离心管中，加入100µl0.1mol/lNaOH，混匀后加入5ml乙醚，涡旋，离心，取乙醚层置另一5ml离心管中，60度水浴氮气流下挥干甲基苯丙胺（冰毒）苯丙胺第40页/共64页液液萃取应用特点调节水相pH值水相pH值主要由药物的pKa确定碱性药物最佳pH值要高于pKa值1-2个pH单位酸性药物则要低1-2个pH单位pKa9.9pKa10.1酸化：0.1mol/lHCl

碱化：0.1mol/lNaOH第41页/共64页3.2.4.固相萃取solid-phaseextractionSPE

★根据色谱理论发展的一种前处理方式将具有吸附、分配或离子交换性质的担体作为萃取剂填入小柱，溶剂淋洗活化后，将生物样品通过小柱，使其药物或杂质保留在担体上，选择一种溶剂洗去杂质，再用适当溶剂将药物洗脱下来。常用担体：疏水性的C18化学键合硅胶等第42页/共64页固相萃取基本操作固定相C18先甲醇润湿小柱

再用水除去多余甲醇1)活化第43页/共64页固相萃取基本操作1)活化2)上样液体样品内源性物质其他外源性物质待测药物第44页/共64页固相萃取基本操作1)活化2)上样3)淋洗选择不同极性溶剂

依次为：水，由低到高比例的甲醇内源性物质其他外源性物质待测药物淋洗溶剂第45页/共64页固相萃取基本操作1)活化2)上样3)淋洗淋洗的目的：除去生物样品的干扰，待测药物仍然保留在SPE柱上内源性物质其他外源性物质待测药物淋洗溶剂第46页/共64页固相萃取基本操作1)活化2)上样3)淋洗4)洗脱100%甲醇为洗脱剂内源性物质其他外源性物质待测药物淋洗溶剂洗脱溶剂第47页/共64页固相萃取基本操作收集洗脱液，其中含有待测药物直接进样分析

浓缩后进样分析待测药物洗脱溶剂1)活化2)上样3)淋洗4)洗脱第48页/共64页固相萃取基本操作内源性物质其他外源性物质待测药物淋洗溶剂洗脱溶剂活化上样淋洗洗脱第49页/共64页固相萃取应用特点根据药物性质选择适合的柱填料，以提高提取回收率处理速度快，具有一定通量，较容易自动化或联用第50页/共64页3.2.5其他处理方式固体样品均匀化处理组织样品——按照1:4(w/v)用生理盐水或缓冲液进行匀浆，匀浆前剪碎组织粪便样品——低温烘干后，取样品研碎，用适当溶剂萃取（超声）注意保证取样均一第51页/共64页523.2.5其他处理方式缀合物的水解药物或者其代谢产物与体内内源性物质结合生成的产物称为缀合物。常见葡萄糖醛酸苷缀合物和硫酸酯缀合物缀合物较原型药物具有较大的极性，有机溶剂不易提取。常用酸水解、酶水解的方法使药物释放出第52页/共64页血浆中NM394的样品前处理液液萃取：有一定水溶性，提取溶剂中需要加入一些极性溶剂蛋白沉淀：完全可以固相萃取：完全可以本实验研究选择蛋白沉淀为前处理方法：200μl血浆+50μl内标溶液+100μl

10%高氯酸溶液→涡旋混匀3min

→10000rpm离心10min

→上清液取出二次离心10000rpm10min

→上清液20μl进样HPLC分析考察不同蛋白沉淀剂对方法专属性的影响，和对绝对回收率的影响——决定的检测灵敏度第53页/共64页3.3体内样品分析方法学验证特异性标准曲线与定量范围定量下限精密度与准确度稳定性提取回收率分析过程质量控制超限样品处理3.体内药物分析方法的建立与评价专属性标准曲线与定量范围定量限/检测限精密度与准确度耐用性质量标准分析方法验证内容体内样品分析方法学验证内容概念相似方法不同第54页/共64页血浆中NM394检测的特异性内标NM394内源性物质是否有干扰未知代谢物是否有干扰与色谱分析方法有关与前处理方法有关第55页/共64页血浆中NM394检测的提取回收率提取回收率又叫绝对回收率，指从生物样品中回收得到待测物的响应值与标准物质产生的响应值的比值。

180μl血浆+20μl1

μg/ml对照品溶液=200μl标准添加血浆0.1μg/ml前处理：+50

μl内标溶液+100μl

10%高氯酸溶液沉淀浓度0.1*0.2/0.35→分子上的响应值流动相配制浓度为0.1*0.2/0.35的对照品溶液→分母上的响应值第56页/共64页血浆中NM394检测的提取回收率评价分析方法将体内样品中的待测物从生物基质中提取出来的能力★提取回收率高，检测灵敏度就高要求在不同浓度上，具有较为接近的提取回收率即可测定浓度μg/ml提取回收率0.0278.30.1081.50.8084.3第57页/共64页血浆中NM394的线性范围、定量下限采用内标工作曲线法定量