生化分离工程实验

生化分离工程实验第一页，共三十八页，2022年，8月28日助教学生：赵有文

刘舒

胡轶敏

危雅乐第二页，共三十八页，2022年，8月28日1组李佳佳（组长）董奇峰吴婷婷杨后召2组范文瑾（组长）谢贻天熊雅琪罗文3组刘小翠（组长）张箐

郑琦

孟庆4组罗云超（组长）刘浩宇黄玮

李智5组唐清（组长）李斌

严楠峰

柴芝培6组白腾龙（组长）伍良伟

余乐

裴媛筠7组邹铮铮（组长）刘娟

尹学琳

王海云8组赵鹏（组长）张灵芬

潘丽娜

余晓岚第三页，共三十八页，2022年，8月28日菌株的优化培养总DNA或RNA的抽提PCR或RT-PCR扩增目的基因乙醇沉淀回收线性化片断大肠杆菌表达载体pET-28酶连产物转化E.coliDH5挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证)检索感兴趣的基因（hfq/fabz）直接优化并合成连T载测序第四页，共三十八页，2022年，8月28日重组表达质粒转化E.coliBL21挑取重组子,用菌落PCR方法验证IPTG诱导促使目的大量蛋白表达细胞破碎及蛋白抽提目标蛋白的纯化蛋白质浓度测定--Bradford法目标蛋白的鉴定—Westernbiotting结晶结构解析本次试验内容第五页，共三十八页，2022年，8月28日本次试验的主要内容His-Tag系统pMAL系统无细胞体系第六页，共三十八页，2022年，8月28日目的基因的背景资料HfqfabZHfq是一个高度保守的RNA结合蛋白，最初被发现是作为大肠杆菌RNA噬菌体Qβ复制所必需的管家因子。现在则被认为是细菌基因转录后调控的关键因子，广泛参与细菌多种生命活动的调控。大肠杆菌fabZ基因编码3-羟基脂酰ACP脱水酶，是大肠杆菌中的必须基因，该基因的突变会导致细菌细胞的死亡。第七页，共三十八页，2022年，8月28日生化分离工程实验（星期五）一，接种按1%的接种量将两种菌株分别加入到含抗生素的LB培养基中,做好标记（写清组号，菌株信息、抗性），统一放于第八组台面。系统His-Tag系统pMAL系统菌株编号HAZJH022宿主菌大肠杆菌BL21大肠杆菌DH5α目的基因hfqfabZ培养基LB培养基LB培养基接种量1%（2ml）1%（2ml）加入抗生素Kan（200ul）Amp（200ul)第八页，共三十八页，2022年，8月28日生化分离工程实验（星期五）将超净台内PA瓶中剩余的菌液用枪吸取200µl于1.5ml离心管中，10000rpm/min离心1min，弃上清，加入200µl的无菌水洗涤菌体上残留的培养基10000rpm/min离心1min，弃上清，然后重悬于40µl灭过菌的去离子水中，100℃煮15min，10000rpm/min离心1min，取上清9.2µl作为菌落PCR的模板。二，菌液PCR（验证目的基因已转入宿主菌中）第九页，共三十八页，2022年，8月28日PCR体系H2O9.2µl10XPCRbuffer2.5µldNTP2.0µl上游引物0.5µl下游引物0.5µlTaq酶0.3µl模板10µl总体积25µlPCR程序95℃5min95℃35s56℃40s72℃60s72℃10min25℃10minCycle30注：用质粒做阳性对照，水做阴性对照，不用重复，PCR管上做好标记！第十页，共三十八页，2022年，8月28日第十一页，共三十八页，2022年，8月28日第十二页，共三十八页，2022年，8月28日

ThepMAL-c2seriesofvectorshaveanexactdeletionofthemalEsignalsequence,resultingincytoplasmicexpressionofthefusionprotein.ThepMAL-p2seriesofvectorscontainthenormalmalEsignalsequence,whichdirectsthefusionproteinthroughthecytoplasmicmembrane,andthefusionproteinscanbeexportedtotheperiplasm第十三页，共三十八页，2022年，8月28日表达系统His-TagpMAL菌株HAZJH022培养温度37℃37℃转速200rpm/min200rpm/min适宜状态OD600=0.6OD600=0.5所需时间2.5h2.5h加入IPTG的终浓度1.0mM(2ml)0.3mM(0.6ml)三，诱导注：在加入IPTG之前，摇匀菌液并各取1ml于1.5ml的离心管中，做好标记（组号，菌液名）记作“诱导前”，放于第八组桌面的离心管板中，于—20℃保存。第十四页，共三十八页，2022年，8月28日四，配试剂五，PCR结果依据每组发的纸条进行第十五页，共三十八页，2022年，8月28日生化分离工程实验（星期五）将加入诱导剂后的菌液再放入37℃200rpm/min的摇床中诱导培养4-5小时后收集菌体。菌株HAZJH022沉淀（离心管对应配平）8000rpm/mim离心5min8000rpm/mim离心5min收菌弃上清，沉淀用10mlbindingbuffer重悬弃上清，沉淀用10mlcolumnbuffer重悬保存—20℃—20℃注：在离心沉淀之前摇匀菌液取1ml于1.5ml的离心管中，做好标记（组号，菌液名）记作“诱导后”放在第八组的离心管板上。

离心时用天平严格配平，沉淀重悬后做好标记放于第八组桌面上！六，收菌第十六页，共三十八页，2022年，8月28日组氨酸和Ni-NTAimidazole

第十七页，共三十八页，2022年，8月28日亲和作用原理第十八页，共三十八页，2022年，8月28日6×His/Ni-NTA亲和纯化步骤第十九页，共三十八页，2022年，8月28日系统原理示意图pMAL第二十页，共三十八页，2022年，8月28日Ni柱的清洗与保存第二十一页，共三十八页，2022年，8月28日用水洗3次（去掉保存的20%乙醇）充电（装满NiSO4，温和摇动后自然沉降）洗涤（3次水洗，去掉游离的Ni)平衡（2次的bindingbuffer洗）1234His—Tag蛋白质的纯化步骤上样（每次15ml，样品要与柱子充分结合）加washingbuffer（用100%TCA检测不出沉淀为止）加Elutionbuffer（一般收集8ml）重复第4~8步5678第二十二页，共三十八页，2022年，8月28日第1步：2倍体积6M盐酸胍，0.2M醋酸第2步：2倍体积水第3步：1倍体积2%SDS（注意低温容易析出）第4步：1倍体积25%乙醇第5步：1倍体积50%乙醇第6步：1倍体积75%乙醇第7步：5倍体积100%乙醇第8步：1倍体积75%乙醇第9步：1倍体积50%乙醇第10步：1倍体积25%乙醇第11步：1倍体积水第12步：5倍体积100mMEDTA，pH8.0第13步：3倍体积水由于EDTA处理后仍可有少量蛋白未能完全释放，建议在纯化不同蛋白时应另换His·Bind树脂。树脂的再生当柱流速明显下降，或树脂在使用离子化缓冲液处理之后没能显示深蓝绿色，则树脂需要更彻底的清洗处理。第二十三页，共三十八页，2022年，8月28日直链淀粉柱的再生水3倍柱体积0.1%SDS3倍柱体积水1倍柱体积Columnbuffer3倍柱体积第二十四页，共三十八页，2022年，8月28日生化分离工程实验（星期六）一、裂解细胞将冷冻保存的细胞团在室温下解冻，冰上破碎至菌液成澄清（200-300w超声6×10s-10s，约20min）,天平严格配平后10000*g，4℃，离心20min。上清取1ml于1.5ml离心管中，作标记为“上清”，沉淀用1ml对应的buffer（his-tag为bindingbuffer，pMAL为columnbuffer）重悬后，保存在1.5ml的离心管中，标记为“沉淀”，做好组号和菌株标记后，放于第八组台面。第二十五页，共三十八页，2022年，8月28日二，蛋白纯化系统His-Tag系统pMAL系统柱子类型Ni-NTA柱支链淀粉柱操作方法3次bindingbuffer平衡3次columnbuffer平衡堵住下端后上样（10ml）静止5min，盛接流出液后再上样，重复三次上样（10ml）静止5min，盛接流出液后再上样，重复三次收集最后一次穿透液，取1ml于1.5ml离心管中，标记“穿透”收集最后一次穿透液，取1ml于1.5ml离心管中，标记“穿透”6次washbuffer水洗Columnbuffer+10mM麦芽糖的溶液洗涤（每加1ml用1.5ml离心管收集)共收集7管，做好标记Elutionbuffer洗涤（每加1ml用1.5ml离心管收集)共收集7管，并做好标记第二十六页，共三十八页，2022年，8月28日系统His-Tag系统pMAL系统操作步骤Elutionbuffer洗涤2次buffer+10mM麦芽糖的溶液洗涤2次加入20%乙醇保存加入20%乙醇保存后续反应酶切去除标签注：收集到的蛋白做好标记后须在冰上保存，避免其失活pMAL™系统MBP标签的切除从A595最大的几管(一般是第一、二管)取100µl用于蛋白酶FactorXa的酶解，在100µl洗脱液中取15ul保存在pcr管中，作为酶切对照，剩下的加入2ul的FactorXa后置于摇床上震荡反应，室温下反应18h，分别于第1h、3h、6h、17h取样15µl。第二十七页，共三十八页，2022年，8月28日三，SDS—PAGE样品的制备将收集到的14管目的蛋白和之前保存的“上清”“沉淀”“穿透”（共6管）蛋白各取出20ul于对应的已经标记的1.5ml离心管中，加入20ulSDSloadingbuffer，将先前保存的“诱导前”“诱导后”（共4管）于10000rpm/min离心1min，弃上清，沉淀用15ul对应的buffer重悬，再加入15ulSDSloadingbuffer，沸水浴15min后，放于第八组台面。第二十八页，共三十八页，2022年，8月28日无细胞体系第二十九页，共三十八页，2022年，8月28日生化分离工程实验（星期六）四，Bradfordproteinassay1、标准曲线的制作（1）标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成1.0mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用蒸馏水稀释至1L。第三十页，共三十八页，2022年，8月28日管号1234567标准蛋白质（ml）00.010.020.040.060.080.10蒸馏水（ml）0.10.090.080.060.040.020考马斯亮蓝G-250试剂（ml）5555555A595每加完一管立即在漩涡振荡器上混合，2~5min后以1号为对照调零测A595以标准蛋白质量（ug）为横坐标，用吸光度A595为纵坐标作标曲注;震荡过程中不要太剧烈，以免产生较多气泡而无法消除第三十一页，共三十八页，2022年，8月28日管号1234567HAZ和Fabz(ml）0.050.050.050.050.050.050.05蒸馏水（ml）0.050.050.050.050.050.050.05考马斯亮蓝G-250试剂（ml）5555555HAZA595FabzA595五，未知蛋白浓度的测定将保存的纯化的蛋白各取50ul，加50ul蒸馏水后再加入5ml考马斯亮蓝G-250染液试剂，漩涡震荡后静止2~5min，以0.1ml水加5.0ml的G-250试剂调零，测其在595nm处的吸光度。第三十二页，共三十八页，2022年，8月28日生化分离工程实验（星期六）六，

配制SDS试剂分离胶（12%)浓缩胶(5%)ddH2O9.0ml5.0ml40%丙烯酰胺6ml1.0ml分离胶-buffer5.0ml不加浓缩胶-buffer不加2ml10%APS100μl60μlTEMED20μl20μl总体积20ml8ml每组配两块，均采用15孔梳子注：在配胶前注意梳子厚度（1.0mm和1.5mm）与胶板厚度的一致性第三十三页，共三十八页，2022年，8月28日生化分离工程实验（星期天）跑SDS点样：所有的样品和蛋白Marker点样前都要沸水浴5分钟使蛋白质完全变性。一般的点样量为10-20ul。(记录点样顺序)点样完毕后即可开始电泳，先以80伏电压跑15-20分钟，蛋白质通过积层胶后，更换到1