单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

单克隆抗体的制备、纯化及鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑涵盖了细胞培养胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容了解单克隆抗体制备的原理主要步骤和方法。二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞继承了两个亲代细胞的特性既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在培养基[含有次黄嘌呤H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞在体内或体外培养即可无限制地大量制备单克隆抗体。三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2养箱、倒置显微镜等。四、操作方法：1、抗原制；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。A．可溶抗原（蛋白质）以～ml溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量.3ml～间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。B.颗粒性抗原如抗原来源方便可以不加佐剂而增加免疫次数缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０２每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫动；目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。就品系而言以c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以周龄为宜。大白鼠也可产生较多量的单克隆抗体已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人杂交瘤技术。免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生××种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的巴细胞大量增加。B巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响人认为处在转化时期的B巴细胞可能更易于融合，而免疫以后天，虽然是抗体产生的高峰时期但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。3、免疫脾胞和骨髓瘤细胞的制备；脾细胞制备免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠颈或用处死小白鼠。将小鼠放于70酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。把脾放入5ml有％FCS的1640中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。用镊子轻轻挤压脾做成脾细胞悬液用毛细管将悬液移入小试管中。直立小试管使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。以2.5FCS1640充满离心管，并以心～（与此同时应开始制备骨髓细胞）。把沉淀用约新鲜培养液再悬浮。重复⑹、⑺步骤。计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。骨髓瘤细胞制备骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白这样的瘤细胞融合后可能影响或降低所分泌抗体的滴度以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。选择骨髓瘤细胞的条件该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系以便两者的组织相容性抗原一致②骨髓瘤细胞必须是静息状态不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度最好6细胞/ml④生长速度快，繁殖时间短。目前常用的Balb/c鼠产生的骨髓瘤细胞株有：S194/5XXOBU1；②SP20Ag14（简称）；P2—？—Ag8·6·5·（简称653）；以653为常用，它是由矿物油4－甲基－15（，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（MinerolOil，）并经过培育成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入存于-液氮罐中验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶7777处理为了防止出现返祖现象在融合前可将培养基内加入158－氮鸟嘌呤。取约110～×10对数生长期（即培养15h～）的骨髓瘤细胞，在室温离400g淀以2.5—1640再悬浮并计数。饲养细胞在体外的细胞培养中单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feedercell）在细胞融合和单克隆的选择过程中是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体因此在这一过程中必须使用饲养细胞许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞应用腹腔渗出细胞的好处是一方面做饲养细胞另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片为融合细胞的生长造成良好的环境腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。拉颈处死小鼠。70酒精浸泡消毒用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。用注射器将4ml％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。1／min心。取上清HAT选择培养液将细胞制成悬液盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40个活细胞。以1ml管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。4、细胞融；鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的B淋巴细胞在一般培养某中不易存活。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的B淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇P）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有B巴细胞分泌特异性抗体的能力，在选择培养基中可以选择得到杂交细胞种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁殖生长培养液上清中可以收集到大量某B淋巴细胞产物——单克隆抗体。取末次免疫后的3小鼠脾细胞悬液，将108小鼠脾细胞与1-5×小鼠骨髓瘤细胞混合于50升刻度离心管中，经转/分离心7钟；弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；37水浴中保温的毫升（实际应用0.7毫升）用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；加完后，将细胞悬液放在℃水浴中静置90钟，立即在24钟内加入15升无血清的养基（℃），开始要一滴一滴地加，由于稀释使停止作用。注意尽可能不搅动细胞；再经100/分离心10钟。弃去上清液，加毫升HAT培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个培养板中，每孔0.5毫升；将培养板放在水蒸汽饱和CO2孵箱中37℃孵育CO2量为每2—3天换一次培液，连续2观察杂交瘤细胞是否出现。2周后使用HT培基。杂交瘤细胞的选择培养；杂交瘤细胞的筛选；杂交瘤细胞的克隆化；单克隆抗体的检定；分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；单克隆抗体的大量制备。五、关键步骤与注意事项：整个制备过程需严格无菌细胞传代培养时注意适时更换培养液杂交瘤细胞的大量繁殖克隆化的细胞可以在体外进行大量培养集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体不过体外培养法得到的单克隆抗体有限其不能超过特定的细胞浓度且每天要换培养液而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的000。利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。1．材料经高压灭菌的降植烷。Balb/c鼠：周龄。杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。RPMI—1640养液（5）新生牛血清2．操作方(1)于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周内种植细胞。收取对数生长期的杂交瘤细胞，用５％FCS—洗涤一次，1000r/min离心。取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用５FCS1640配成1.0×细胞/ml悬液。给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射含1.0107个细胞/ml。接种后10左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3取1，可取10。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。单克隆抗体的提纯1．材料(1)20mMol/L—HCl缓冲液20mMol/L(2)20mMol/L—HCl缓冲液40mMol/LNaCl(3)20mMol/L—HCl缓冲液80mMol/L20mMol/L—HCl缓冲液饱和硫酸铵液DEAE纤维素柱2．操作方（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4后，于1.00×转离心，去沉淀。在4℃于清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为％硫酸铵浓度。此溶液置冰中然后5离心10min去上清。（4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/LNaCl）中（溶可能混浊）。（5）装入透析袋于Tris－HCl冲液（20）中透析除盐。离心去沉淀。溶液稀释（或更高倍稀释）后，于测蛋白含量，估计蛋白质含量1A白质一般每ml水中，含有总蛋白约。（8）过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以Tris缓冲液平衡。透析样品以缓冲液等量稀释。样品进入柱床速度为，以形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体120mMol/LmMol/LNaCl洗脱。测收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。杂交瘤产生各种免疫球蛋白但主要是IgG究竟是哪种为主则决定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞免疫多次的多为IgG。单克隆抗体的鉴定1．杂交瘤胞染色体的检查采用秋水仙素裂解法进行。2克隆抗体的类型型的测定购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig型和亚型。．单抗的特异性鉴定以采用各种方法如免疫荧光法ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。单抗的效价测定可采用凝集反应ELISA放射免疫测定不同的测定方法效价不同培养上清液的效价远不如腹水的效价采用凝集反应腹水效价可达5×。而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。．必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。动物的选择目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。就品系而言以小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以龄为宜。大白鼠也可能产生较多量的单克隆抗体现在已经在小鼠杂交瘤的基础上发展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人杂交瘤技术。免疫7777一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生××种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的巴细胞大量增加。B巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响人认为处在转化时期的B巴细胞可能更易于融合，而免疫以后天，虽然是抗体产生的高峰时期但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。1．可溶性原（蛋白质）以～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量.3ml～，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗0.2ml～0.4ml，天后，杀死小鼠取脾做融合用。２.粒性抗原如抗原来源方便以不加佐剂而增加免疫次数短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０２ml每周２次，共免疫５～８次取脾前３天免疫一次即可有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。单克隆抗体技术：细胞的选择脾细胞1．材料免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。1640养液2.5％－1640营养液2．操作方拉颈或用CO2处死小白鼠。将小鼠放于70酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。把脾放入5ml有％FCS的1640中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。用镊子轻轻挤压脾做成脾细胞悬液用毛细管将悬液移入小试管中。直立小试管使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。以2.5FCS1640充满离心管，并以心～（与此同时应开始制备骨髓细胞）。把沉淀用约新鲜培养液再悬浮。重复⑹、⑺步骤。计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白这样的瘤细胞融合后可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致②骨髓瘤细胞必须是静息状态不产生球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度好106细胞/ml④生长速度快，繁殖时间短。目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXOBU1；②／0—Ag14（简称SP2）；③P2—X？—Ag8·65·3（简称；④以653为常用，它是由矿物油4－甲基－15（，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（MinerolOil，）并经过培育成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态很容易脱落因此不需要胰酶处理为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加μg/ml氮鸟嘌呤。取1107～6×对数生长期（即培养20h的骨髓瘤细胞，在室温离心（，沉淀以2.5％FCS1640再悬浮并计数。饲养细胞在体外的细胞培养中单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder）。在细胞融合和单克隆的选择过程中是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体因此在这一过程中必须使用饲养细胞许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞应用腹腔渗出细胞的好处是一方面做饲养细胞另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片为融合细胞的生长造成良好的环境腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。1．材料（1）小鼠（C57小白鼠）若干只。（2）11.6％蔗糖溶液（经磅高压灭菌）。2．操作方拉颈处死小鼠。70酒精浸泡消毒用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。用注射器将4ml蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。1／min心取上清，以AT择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40个活细胞。以1ml管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2个细胞，放入培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。单克隆抗体技术：抗体检测用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的测抗体的方法很多从沉淀反应到放射免疫测定由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应杂交瘤产生的抗体则是单克隆的以并不是每项方法都能适用要选择敏感的、快速的、一次又能检测多份样品的方法。常用的检测方法如下：１．试管溶血反应检测法材料：①杂交瘤细胞，换液后至少两天才收取培养液；②绵羊红血球，洗涤三次后配成1悬液③豚鼠补体无菌采取补体pH7.2PBS稀释成％溶液，分装小瓶，于﹣℃保存。使用时以补体和压积红血球5:1（）的量进行吸收，4，然后2000r/min离心，去红血球，取上清液备用；④0.01Mol/LpH7.2PBS液。操作方法①在小试管中加入杂交瘤细用过的培养液再加入0.1mlpH7.2的PBS，然后倍比稀释至一定的稀释度；②加入0.1ml补体和1％绵羊红血球混匀后置37℃水浴1h③观察结果以绵羊红血球完全溶解的杂交瘤细胞培养液的最高稀释倍数为抗体的溶血效价。2斑点检测法抗红血球表面的单克隆抗体与浇灌在琼脂板的红球结合进而结合补体，而发生溶血斑点，对着光源用肉眼即可判定。材料：①绵羊红血球，处理同试管法，最后配％红血球悬液；②新鲜豚鼠血清（同试管法处理）；③琼脂糖，配成％PBS，水浴中溶化；④0.01Mol/L；⑤兔抗羊红血球抗体。操作方法：①将溶化0.6琼脂糖倒入一试管中，置℃～水浴中；②加25％红血球悬液0.1ml豚鼠补体迅速混匀倾注一干净载玻片上；③凝固后在凝胶表面固定域滴加2ml待测样品标准阳性血清和对照试液；④待溶液全部渗入凝胶后置湿盘⑤温育～2h观察并判定结果。强阳性（）中等阳性（）弱阳性（）阴性（﹣）必要时可置室温过夜，再判定一次。3．膜荧光测法（1）材料：①培养HEM或RPMI－1640②荧光试剂：异硫氰酸荧光素FI）标记的抗小鼠免疫球蛋白；③％甘油缓冲液：1甘油加1体积Mol/LpH液混合即成；④荧光显微镜、载玻片、盖玻片、吸管等。（2）操作方法：①用培养液洗涤二次细胞，悬浮成2.0107ml；②细胞悬液加50l养上清液混合，置4℃30min，用培养液洗涤3，1000r/min离心；③50µlFITC—抗小鼠免球蛋白重新悬浮压积细胞水浴30min～60min；④用冷培养液洗3细胞，重新悬浮；⑤取一滴细胞悬液滴在玻片上，复盖片，用甘油缓冲液封固，置荧光显微镜下观察。着色细胞也可以在固定后观察，一滴细胞悬液，涂片、风干，用％酒精固定10min固定后的载玻片用PBS洗涤，盖上盖玻片，进行观察。4球蛋白和亚类球蛋白的检测以琼脂双扩散试验法进行简单易操作，特异性好。注意必须将培养液浓缩～倍，否则做双向琼扩不出现沉淀线。其检测方法为：（1）制备各种兔抗小鼠、IgM1~2、IgA1~2和K、λ抗血清也可直接购买。取5ml养物的上清液缓慢加入0.5ml的饱和硫酸铵溶液混匀静置，离心沉淀，去上清，沉淀加馏水溶解。制成1％琼脂糖凝胶板，打孔。中间孔20μl缩上清液，周围孔加l特异性抗血清，以10l常小鼠血清作对照。也可以采用酶联免疫吸附试验接血凝试验以及放射免疫等方法检测。单克隆抗体的制备杂交瘤细胞的大量繁殖克隆化的细胞可以在体外进行大量培养集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体不过体外培养法得到的单克隆抗体有限其不能超过特定的细胞浓度且每天要换培养液而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的000。利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。1．材料经高压灭菌的降植烷。Balb/c鼠：周龄。杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。RPMI—1640养液新生牛血清2．操作方(1)于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周内种植细胞。收取对数生长期的杂交瘤细胞，用５％FCS—洗涤一次，1000r/min离心。取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用５FCS1640配成1.0×细胞/ml悬液。给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射含1.0107个细胞/ml。接种后10左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3取1，可取10。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。单克隆抗体的提纯1．材料(1)20mMol/L—HCl缓冲液20mMol/L(2)20mMol/L—HCl缓冲液40mMol/LNaCl(3)20mMol/L—HCl缓冲液80mMol/L20mMol/L—HCl缓冲液饱和硫酸铵液DEAE纤维素柱2．操作方（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4后，于1.00×转离心，去沉淀。在4℃于清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为％硫酸铵浓度。此溶液置冰中然后5离心10min去上清。（4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/LNaCl）中（溶可能混浊）。（5）装入透析袋于Tris－HCl冲液（20NaCl）中透析除盐。离心去沉淀。溶液稀释（或更高倍稀释）后，于测蛋白含量，估计蛋白质含量1A白质一般每ml水中，含有总蛋白约。（8）过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以Tris缓冲液平衡。透析样品以缓冲液等量稀释。样品进入柱床速度为，以形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体