植物基因组DNA的提取

植物基因组DNA的提取植物基因组DNA提取的方法主要有：SDS法CTAB法是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸，重要用途提取DNA和RNA。第1页/共21页第一页，共22页。1、实验原理SDS、CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白（DNP）解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入冰无水乙醇或者异丙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。第2页/共21页第二页，共22页。第3页/共21页第三页，共22页。CTAB法CTAB法，是1980年Murray和Thompson修改而成的快速简便提取植物DNA的方法。

第4页/共21页第四页，共22页。CTAB法十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammomumbromide，简称为CTAB)，为阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，在高盐溶液（>0.7mol/LNaCl）中可溶，当盐浓度降低到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，可沉淀CTAB-核酸的复合物，通过有机溶剂抽提和离心沉淀即可除去蛋白质，多糖和酚等杂质。最后通过冰乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB因溶于冰乙醇或异丙醇而被除去。第5页/共21页第五页，共22页。2、材料、仪器、试剂2.1材料水稻幼苗叶子2.2仪器高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅、研钵、50mL离心管及1.5mLEppendorf（EP）管、移液枪及枪头、药匙。第6页/共21页第六页，共22页。2、材料、仪器、试剂2.3试剂CTAB提取液：2%CTAB，100mMTris-HCl（pH8.0），20mMEDTA（pH8.0），1.4MNaCl，0.1%PVP（聚乙烯吡咯烷酮），2%β-巯基乙醇；第7页/共21页第七页，共22页。第8页/共21页第八页，共22页。2.3试剂氯仿-异戊醇（24:1，v/v）氯仿是使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分开，而异戊醇可降低表面张力，从而可消除抽提过程中出现的泡沫；异丙醇（-20℃预冷）；70%乙醇（-20℃预冷）洗去DNA表面盐类等杂质；

第9页/共21页第九页，共22页。2.3试剂TE缓冲液（pH8.0）：10mMTris-HCl，1mMEDTA（pH8.0），121℃高压蒸汽灭菌TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+抑制DNase活性，且pH为8.0，可防止DNA发生酸解；10mg/mLRNaseA；液氮第10页/共21页第十页，共22页。3、方法与步骤在CTAB提取液中加入2%β-巯基乙醇，在65℃水浴锅中预热（CTAB需在65℃保温溶解，充分混匀后使用）；取幼嫩的水稻叶子0.5g，洗净、吸干、剪碎（冻存材料必须直接研磨，绝对不能化冻；研磨后的粉末应在化冻前转移，否则内源性DNase有可能降解）第11页/共21页第十一页，共22页。3、方法与步骤③移入经过预冷的研钵中，加入液氮研钵至粉末状，用干净的灭菌不锈钢药匙快速转移粉末至1.5mL离心管中；加入250μL的CTAB提取液，总体积达到500μL，混匀后置65℃磁力搅拌水浴锅中保温60min；④加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻地颠倒混匀，室温下12000rpm离心10min，移至上清至新1.5mLEP管；（可重复④，抽提两次）第12页/共21页第十二页，共22页。3、方法与步骤⑤加入1倍体积的冰异丙醇或者2倍体积冰无水乙醇，颠倒混匀，冰浴1h，或者-20℃放置30min，或-80℃放置10min；⑥室温下12000rpm离心10min（可离心时间长一些）；⑦弃上清，用70%冰乙醇清洗沉淀两次；⑧室温晾干约20~30min；⑨加入100μLTE缓冲液，加入2μLRNase，37℃放置30min，或者室温放置1h；⑩-20℃保存。第13页/共21页第十三页，共22页。4、注意事项CTAB在低于15℃时溶于沉淀，所以使用之前要65℃时预热，用前再加巯基乙醇或者加入亚精胺（100μLDNA加5μL0.1M的亚精胺）；在研磨前，研钵里不得有任何水分，否则加液氮时容易结冰；在用不锈钢灭菌后的药匙移取粉末时，可用枪头的大头移取；第14页/共21页第十四页，共22页。4、注意事项在加入氯仿-异戊醇抽提离心后，拿出离心管时动作要轻缓，吸取上层溶液时所用的枪头要减去下面尖端部分，吸取时不要吸取中间的蛋白质层；用70%的乙醇洗DNA后，要使乙醇完全挥发，否则会对后续的PCR产生影响，甚至对限制性酶作用产生非特异性；第15页/共21页第十五页，共22页。4、注意事项最后溶于TE缓冲液中：在无离子水溶液中，低浓度的核酸由于磷酸基负电荷的排斥作用会引起变性。第16页/共21页第十六页，共22页。第17页/共21页第十七页，共22页。星星活性星星活性（staractivity）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。影响星星活性的因素有很多：甘油浓度高（>5%），酶过量（>100U/μL）,离子强度低（<25mM），pH过高（>8.0），或者加入了有机溶剂DMSO（二甲基亚砜），乙醇，乙二醇，或者用其他二价离子如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+代替了Mg2+。第18页/共21页第十八页，共22页。4、参考文献[1]钟卫鸿.基因工程技术实验指导[M].北京：化学工业出版社，2007，7.[2]王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学教程[M].北京：高等教育出版社，2008，6.[3]孙明.基因工程[M].北京:高等教育出版社，2006，5.[4]彭学贤.植物分子生物技术应用手册[M].北京：化学工业出版社，2006，2.第19页/共21页第十九页，共22页。Thankyou!第20页/共21页第二十页，共22页。感谢您的观看。第21页/共21页第二十一页，共22页。内容总结植物基因组DNA的提取。CTAB法，是1980年Murray和Thompson修改而成的快速简便提取植物DNA的方法。最后通过冰乙醇