医学交流课件：基因工程制药

第三章基因工程制药概述一、基本概念重组DNA（invitroDNArecombinationtechnology

）：

基因克隆（genecloning）

或分子克隆（molecularcloning）技术。基因工程（geneengineering）：二、基因工程产生的基础1理论上三大发现40年代发现了生物的遗传物质50年代阐明了生物遗传物质的分子机制，WatsonandCrick提出了DNA双螺旋结构模型。60年代确定了遗传信息的传递方式，

2技术上三大发明限制性内切酶和连接酶的发现载体（Vector）的发现：载体相当于运送重组DNA分子到宿主细胞的车子。逆转录酶的发现，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能

一、重组DNA技术的基本过程基因工程要素目的基因的制备和分离DNA重组体的构建DNA重组体扩增和表达重组体筛选和鉴定外源基因的表达表达产物的分离纯化、鉴定

载体酶切目的基因重组体导入受体细胞扩增、抽提和鉴定表达表达产物的分离鉴定大量生产基因工程的基本过程二、基因工程的分类真核基因工程原核基因工程三、重组DNA技术-基因工程与医学的关系1.研究基因的结构功能和活动的规律。2.为疾病的防治、诊断、预后及发病机理的研究开辟新途径。3.研究细胞分化和胚胎发育的本质问题。4.基因治疗。5.促进基础理论的研究。四、基因工程技术制备药物的优势制备很珍贵但利用传统方法难以制备的药可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入研究，可以发现和挖掘更多的内源生理活性物质。内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白工程进行改造和克服。利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。第三节基因工程的酶学和载体第一部分：工具酶限制性内切酶和甲基化酶DNA连接酶DNA多聚酶第二部分：基因工程的载体原核细胞（大肠杆菌）的常用载体： 真核细胞载体：

第一部分：工具酶一限制性内切酶和甲基化酶限制性内切酶的发现限制性内切酶的生理功能限制性内切酶的分类和命名识别和切割位点及切割片段的末端Ⅱ型酶的分类反应系统限制性内切酶的应用1限制性内切酶（restrictionendonuclease)定义发现Arber的假说–限制修饰酶2限制性内切酶的生理功能构成了细胞抵御外源入侵DNA的防御机制提供了细菌种属间进行交叉繁殖的屏障，但又允许外源DNA有某些遗漏，3限制性内切酶的分类和命名三种类型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型命名：EcoRⅠE:Escherichia属Co:coli种R:RY13株Ⅰ：该菌株第一个被发现的核酸内切酶4Ⅱ型限制性核酸内切酶：识别与切割DNA链上同一个特异性核苷酸顺序，产生特异性的DNA片断。1）基本特性识别与切割DNA链上同一个特异性核苷酸顺序切割片段的末端对dsDNA的两条链同时切割，产生3种不同的切口：识别序列：

切割末端：

5‘GTTAAG-3’3‘CAATTG-5’5‘GTT-3’3‘CAA-5’5‘AAG-3’3‘-TTG-5’平末端5‘CTGCAG-3’3‘GACGTC-5’5‘CTGCA-3’3‘-G5‘G-3’3‘ACGTC-5’5‘-粘末端HpaIPatI5‘GAATCC-3’3‘CTTAAG-5’5‘-G-3’3‘CTTAA-5’5‘AATCC-3’3‘G-5’EcoRI3‘粘末端5Ⅱ型酶的分类A:Isochizomers(异源同工酶)，来源不同，识别顺序相同的酶。

SmaⅠXmaⅠ它们识别顺序相同，切割位点不同，产生平头或粘性末端。CCCGGGCCCGGGB:同尾酶（isocaudarner）

5’-GATC-3’3’-CTAG-5’

5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

MboI

BamHI

BglII

来源及识别序列不相同，切割后产生相同的粘性片段6反应系统组成：酶及活性缓冲液（buffer)：影响酶活性因素：DNA的纯度DNA甲基化程度DNA分子结构：线性《环状反应温度反应系统组成

7限制性内切酶的应用

DNA重组组建新质粒组建DNA物理图谱

DNA的分子杂交制备DNA的放射性探针

DNA的序列分析

DNA甲基化碱基的识别与切割。二、DNA连接酶功能:是指催化两条分别具有5’-磷酰基末端与3’-羟基末端的DNA单链连接形成磷酸二酯键的酶常用的连接酶：

T4DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶1T4DNAligase

来自T4感染的Ecoli，MR:68Kd，辅助因子：Mg2+andATP1）反应特性

5’ACG-OHP-AATTCGT-3’TGCTTAA-P+OH-GCA-5’↓ATPMg2+5’ACGAATTCGT3’3’TGCAAGTTCA5’

2）反应体系:10*buffer2ul(66mMTris-HCl,pH7.5,6.6mMMgCl2,10mMMDTT,0.4mMATP)

底物10pM

连接酶：0.01-0.1unit3）反应温度及时间：

16℃，过夜4）用途：粘端DNA或切口间连接，也连接平末端2大肠杆菌DNA连接酶来自Ecoli,Mr:7.4kDa,辅助因子NAD+。作用：封闭双螺旋DNA上具有5’磷酸酰基和3’羟基的缺口（nick）形成磷酸二酯键。无法封闭裂口（gap）。因此可连接粘性末端的DNA片断，不能连接平末端的DNA片断。用途：粘端DNA或切口间连接三DNA多聚酶聚合酶TaqDNA聚合酶逆转录酶(reversetranscriptase)末端脱氧核苷酸转移酶（TerminalDeoxynucleotidaylTransferase）(一）聚合酶功能：以DNAorRNA为模板，催化DNAandRNA的体外合成。以DNA为模板不耐热聚合酶耐热聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

Klenow大片段酶pfu聚合酶

T4(T7)噬菌体DNA聚合酶以RNA为模板

反转录酶共性：需要引物和模板不能起始新的DNA连，催化dNTP连续加到双链DNA分子引物链3‘OH端；不发生从引物模板上解离1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliPolⅠ）

来自E.coli细胞。Mr:109kD。由单一多肽组成。沿DNA模板催化核苷酸聚合，是一多功能酶，有三种活性：

5’-3’外切酶N3’-5’外切酶聚合酶C小片段大片段（Klenow片段）1）5’→3’聚合酶活性在模版指导下，以4种dNTP为底物，催化单核苷酸接合到DNA引物的3’-OH末端。5’CCGOH5’CCGATAGCCTGGCTATCGGAGGCTATCGGA催化合成的要求：模板，4种dNTP，引物，引物与模板形成正确的氢键配对2）双链特异性的5’→3’外切酶活性无dNTP时，从5’末端降解ds-DNA成为5’单核苷酸。

5‘CGCATCGGCGTAATC5‘CATTAG3’GCGTAAGCPC、PG3）单链特异性的3‘-5’外切酶活性无dNTP时从3‘-OH末端降解ss-DNA或游离3’_OH末端成为单核苷酸。5‘CGCATCGGCG5‘CGCGCGPA、PC、PT、PGcoliDNAPolⅠ在基因工程中的用途：制备高比活的DNA探针用于分子克隆DNA序列分析与DNaseI一起使用，进行切口平移通过Okayama_Berg合成cDNA的第二条链

Klenow片段：

E.coliDNA聚合酶的一个大片断。MW:7.6KDa。具有聚合酶I的5’→3’聚合酶活性在模版和引物存在时，以dNTP做底物，沿5’-3’方向合成与模版互补的DNA。对单链DNA有3’→5’外切酶活性，较弱，不适于3‘突出端的平滑化无5’→3’外切酶活性。

Klenow片断用途：填充用限制酶消化dsDNA的3’延伸末端平末端。用32PdNTP进行补平反应，可对DNA3’末端进行标记合成cDNA第二条链。寡核苷酸定向诱变中双链DNA合成在SangerddNTP系统中进行顺序分析。（二）TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。MW:6.5kDa.在模版及引物存在的条件下，催化与模版互补的脱氧核苷酸一次选择性地连接在引物的3‘OH末端上的反应末端A,即粘性末端

5’→3’外切核酸酶活性有链置换的能力。无3’→5’

外切核酸酶活性，无校对功能,易突变。

Mg2+依赖酶用途：DNA序列分析；应用于聚合酶连反应（PCR）,对DNA分子的特定序列体外扩增(产物为粘末端）；

pfuDNAPolymerase有DNA聚合酶活性没有逆转录活性有3‘-5’方向的外切酶活性.产物为平末端但是这些聚合酶的产量比TaqDNA聚合酶低。常用作PCR高保真（三）、逆转录酶(reversetranscriptase)1特性：依赖于RNA的DNA聚合酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶有效的转录RNA成为DNA产物DNA又称cDNA,即互补DNA(ComplementaryDNA)逆转录酶是一个多功能酶2活性：将真核生物的mRNA转录成cDNA。单链DNA或RNA为模板时，使用反转录酶制备杂交探针。标记带5‘突出端的DNA片断。用于双脱氧链法测序反转录PCR。（四）末端脱氧核苷酸转移酶（TerminalDeoxynucleotidaylTransferase）简称末端转移酶（TerminalTransferase）来自小牛胸腺，Mr:34kD,碱性蛋白质。作用：在二价阳离子存在下，催化dNTP沿5‘-3’方向聚合作用逐个顺序加于线性DNA分子的3‘OH末端。不需模版，4种dNTP任意一种可作前体物；只一种dNTP组成有一种核苷酸组成的3’尾巴，同聚物尾巴用途：给载体或cDNA加上同聚尾。

3‘末端用32P标记的dNTP标记。利用非放射性标记物生物素-11-dUTP渗入到DNA片段分子的3’末端。第二部分：基因工程的载体一、概述1载体的概念（Vector）：凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以供插入或克隆目的基因DNA并具有传递运载外源DNA导入宿主细胞能力的片段称为---。条件：自主稳定复制 单一限制性内切酶酶切位点 筛选标记 安全性 分子量小，拷贝数高 插入目的基因的幅度宽2基因工程载体的分类：

大肠杆菌的常用载体： 质粒 噬菌体真核细胞载体： 哺乳动物细胞载体：

SV40衍生载体 逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关载体 痘苗病毒载体酵母细胞的载体： 昆虫细胞的载体：基因工程中载体的来源包括质粒，病毒等二、质粒载体（一）质粒（Plasmid）1定义：质粒是指独立于细菌染色体之外能在细胞内寄生和复制的共价闭合环状双链DNA(covalenty,closedandcirculardouble-strandedDNA，cccDNA)。

2质粒DNA分子构型：三种分子构型：线性(ss-cDNA)：L-构型环状（OCDNA)：一条保持完整环形结构，另一条链有缺口，CD构型超螺旋：共价闭合环状DNA(CCCDNA)，呈超螺旋构型

线性环状超螺旋OCDNALDNASCDNA3质粒的特性质粒具有遗传传递和遗传交换的能力。

质粒具有不相容性4质粒作为载体的优缺点优点：分子量小，易操作。大多有抗性标记易导入宿主细胞缺点：插入外源基因的片断不能太大（二）克隆载体复制起始位点多克隆位点筛选标记1克隆载体三个要素：1）复制子：复制子又称复制起始区，包含控制质粒DNA复制起点和质粒拷贝数等遗传因素。2）选择标记：由质粒编码的选择标记赋予宿主细胞新的表型，用于鉴定和筛选转化有质粒的宿主细胞。最常见的选择标记为抗生素抗性基因，包括氨苄青霉素（amp），四环素（tet），氯霉素（cm），卡那霉素（kan）和新霉素（neo）等。3）多克隆位点：质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成的序列称之为多克隆位点（multiplecloningsite,MCS）。2常用的质粒克隆载体pBR3224363kb;Amprandtetr,拷贝数3000松弛型pUC18质粒图谱（三）表达载体1表达载体具备的条件:

载体能够独立的复制稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于宿主细胞内。

强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。强的终止子。好的核糖体结合位点：SD序列、ATG目的基因插入位点筛选标记2表达载体分类：①原核表达载体非融合蛋白表达载体：启动子和核糖体结合位点启动子包括λ噬菌体PL启动子，T7噬菌体启动子，tac启动子，trc启动子等融合蛋白表达载体。pET系列载体，硫氧还蛋白融合表达载体，Xpress表达系统，GST基因融合系统-pGEX系列载体等。②真核表达载体不带病毒复制子带病毒复制子。真核表达载体含有原核基因序列和真核转录单位，能在大肠杆菌中自我复制，也能在真核细胞中进行表达。（三）突变载体：突变载体pALTER通过对载体抗性的选择来实现筛选突变克隆的目的。（四）报告载体：报告载体是指以易于检测的基因作为报告基因，通过报告基因的表达强度来研究外源调控因子的功能的一类载体。常用的报告基因包括pGL，pCAT，pSEAP，pGFP等。穿梭载体能在真核系统中转化繁殖又能在原核细胞中转化繁殖的载体，大肠杆菌中质粒提取方便，在大肠杆菌中构建，构建完成后转入宿主菌中进行表达。基因工程的宿主细胞原核：细菌：大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌等真核：酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等

第四节目的基因的制备生物合成基因未知基因文库组构建cDNA文库生物合成基因已知(GeneBank可查)聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）逆转录PCR（retrotranscriptionPCR，RT－PCR）化学合成

一、寻找目的基因1基因组文库（genomicDNAlibrary）：是指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片断随即的同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列，包括外显子和内含子序列。

基因组文库应用：

1）原核生物目的基因的分离（目的基因在质粒上）提取质粒DNA→限制性酶切→从DNA凝胶电泳回收不同大小的片段→与载体连接构建物理图谱→探针杂交→分离目的基因。

2）鸟枪法分离基因（目的基因在染色体DNA上）：用限制性内切酶将染色体DNA酶切，得到很多同一般基因大小相当的DNA片断，然后将这些片断混合物随即重组入适当的载体，转化后在受体菌种扩增，再用适当的方法筛选出需要的基因：

2真核生物基因组文库--（cDNA文库）

（含内含子）cDNA文库（cDNAlibrary）建立：

从真核细胞分离总RNA,纯化出mRNA,逆转录合成互补的DNA,再在聚合酶作用下合成cDNA第二条链,然后将双链cDNA插入到载体内,构建重组体,转入宿主菌,得到的克隆总和成为该类细胞的cDNA文库.cDNA文库特征：

包含成熟mRNA的全部信息,即包含该细胞内表达的全部蛋白的编码信息.

它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列。其复杂性比基因组文库低。由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达的所决定的，因此各自的mRNA的种类就不同，由此而产生独特的cDNA文库。二.制备目的基因（一）聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）1基本原理:根据碱基配对原则利用DNA聚合酶催化和dNTP的参与下，引物依赖于DNA模板特性引导DNA的合成。变性（denaturation）：94℃3-5min.

退火（annealing）：55-60℃，1min左右。延伸（extension）：72℃，1min.

从引物的3’-OH进行延伸，合成方向为5’-3’,从而合成2分子与原来基因相互补的片段，每循环一次，DNA分子按指数倍增。一般可得到100bp-5000bp的目的基因。1

PCR反应要点1）模板

DNA模板：0.05-1ug，含单拷贝基因数3*105，

RNA模板：RNA→cDNA2）

DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶：耐高热，粘末端产物

PfuDNA聚合酶：高保真酶。平末端产物3）缓冲系统：4）dNTP浓度：5）引物设计原则：2PCR应用基因结构的研究：基因组制图预测序；分子杂交探针；DNA定型；PCR直接测序；利用免疫PCR检测抗原和抗体。基因表达与调控研究：mRNA检测；调控元件分析；蛋白质和DNA相互作用的研究。基因工程上构建5‘端内切酶接头，构建cDNA文库。医学上用于遗传及传染性疾病的基因诊断。制药中筛选抗肿瘤抗生素。鉴别菌株（二）逆转录PCR（retrotranscriptionPCR，RT－PCR）

mRNA的纯化cDNA第一链的合成cDNA第二链的合成

1mRNA的特征及纯化含量低，占总RNA的1-3%,大小不均。3’端含50-250个poliA（多聚腺嘌呤核苷酸）纯化利用Oligo（dt)固定相（生物素化寡脱氧胸腺核苷酸）。总RNA流经固定相，mRNA吸附于固定相上，tRNA和rRNA流出。洗脱，收集mRNA。寡聚Oligo(dt)吸附在纤维素柱mRNA-dT杂交体洗脱mRNA模板Oligo(dT)逆转录酶mRNAcDNA第一链Rnase,DNApoliISI核酸酶cDNA总RNA（高盐）（三）、DNA化学合成一般DNA合成都采用固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶联等优点，已在DNA化学合成中广泛使用。DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5‘→3’方向延伸，而是由3‘端开始。具体的反应步骤如下：1脱保护基(Deblocking)：脱去核苷酸的保护基团DMT，获得游离的5‘-羟基端。2活化(Activation)：将亚磷酰胺保护的核苷酸单体装入合成柱，形成活性中间体(其3‘-端已被活化，但5’-端仍受DMT保护3连接(Coupling)：活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5‘-羟基发生亲合反应，缩合，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。4、封闭(Capping)：通过乙酰化来封闭为参与反应的羟基。5氧化(Oxidation)：缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，