重亚硫酸盐测序操作方案

重亚硫酸盐测序操作方案一、样品收集1、配制2%低熔点琼脂糖称取0.02g低熔点琼脂糖，倒入1.5mL离心管中，随后加入1mLmPBS溶液，置于100℃金属浴中反复加热并颠倒混匀至完全溶解，取出4℃保存待用。2、收集细胞样品80℃以上热水浴使低熔点琼脂糖溶化。向1.5mL离心管底部加入8μL低熔点琼脂糖，避免产生气泡。迅速吸取细胞样品吹入琼脂糖中，冷却后加入500μL矿物质油覆盖。最后将离心管在热水浴中短暂浸泡使琼脂糖小球成型，取出-20℃保存待用。二、亚硫酸氢盐修饰3、配制DNA细胞裂解液：向20mLTE缓冲液中加入100μL的20mg/ml蛋白酶K。4、向含样品的离心管内加入500μLDNA细胞裂解液，50℃金属浴8h以上，以消化样品。5、在上一步消化进行的同时配制转化液，注意避光亚硫酸氢钠4.75g双蒸水4.5mL2MNaOH3.5mL对苯二酚0.138g共计10mL6、消化完成后，将离心管取出，换液清洗使小球变性：0.3MNaOH，500μL，15min，2次；0.1MNaOH，1mL，5min，1次。7、换液加入500μL转化液，50℃金属浴8h以上，以转化样品，注意避光。8、用TE缓冲液中止转化，1mL，15min，6次。9、用0.2MNaOH脱磺化，500μL，15min，2次。10、用TE缓冲液中止脱磺化，1mL，15min，3次。11、用双蒸水清洗，1mL，10min，2次。12、清洗完成，用枪头吸取琼脂糖小球转移至200μL离心管中，-20℃保存待用。三、甲基化基因的PCR13、使用设计好的两对甲基化特异性引物对转化后的DNA样品进行巢式PCR反应。步骤预变性变性退火延伸终延伸降温温度94℃94℃55~65℃72℃72℃4℃时间2min30s30s30s2min∞第一轮反应体系25μL，转化后琼脂糖小球计为2μLDNA。第二轮反应体系扩大为50μL。试剂25μL反应体系50μL反应体系2×TaqMasterMix12.525RNase-FreeWater8.519ForwardPrimer，10μM12ReversePrimer，10μM12TemplateDNA2214、将第二轮反应产物全量加入胶孔中，跑胶时尽量跑完全程以分离杂带。在紫外灯下找到目的条带，快速精确切取，将胶块放入1.5mL离心管内。四、胶回收15、对胶块称重，向离心管内加入3倍胶体积（0.1g=100μL）QGBuffer，50℃金属浴至胶融化，同批样品可统一为450μL，以便于离心。16、加入1倍胶体积（150μL）异丙醇，颠倒混匀后将液体移入离心柱离心，13000g，1min。17、倒掉收集管内液体，向离心柱内加入500μLQGBuffer，再次离心，13000g，1min。18、倒掉收集管内液体，加入750μLPEBuffer，静置2min，再次离心，13000g，1min。19、更换收集管再次离心，13000g，1min，倒置离心柱在滤纸上晾干2min，再插入新收集管。20、将25μLEBBuffer精确加至离心柱中心内膜，静置3min后离心，18000g，10min。21、取少量收集管内DNA溶液检测样品浓度（分光光度计或跑胶检测），余下-20℃保存待用。微量分光光度计：测定DNA浓度并记录，连接T载体时稀释各组至合适的统一浓度。跑胶：取5μLDNA样品与1μL6×loadingbuffer混合，点样跑胶检测目的条带，依据目的条带亮度决定连接T载体时的DNA上样量。（亮1μL；中等2μL；弱3μL）五、克隆测序22、预先制冰，将pMD18-TVectorCloningKit冰上解冻，依次向200μL离心管内添加：高DNA浓度中DNA浓度低DNA浓度T载体1μL1μL1μLDNA样品1μL2μL3μL双蒸水3μL2μL1μL共计5μL混匀后，加入5μLSolutionI；再次混匀，放入PCR仪中16℃连接8h。23、在上一步连接进行的同时，配制LB/AMP培养基（1）配制LB液体培养基（200mL）1%(w/v)Tryptone2g0.5%(w/v)YeastExtract1g1%(w/v)NaCl2g定容后，加入200μL2MNaOH将pH值调至7.0，混匀后移入玻璃瓶内。（2）配制LB固体培养基（200mL）再配制200mLLB液体培养基，随后倒入含3g琼脂粉的烧杯中，（3）将两种培养基与玻璃棒、涂板小杆等一同高压灭菌。（4）高压后冷却至40~50℃时，向200mLLB固体培养基内加入200μL100mg/mLAmpicillin,向150mLLB液体培养基内加入150μL100mg/mLAmpicillin，剩余50mL不加Ampicillin。（5）摇匀LB固体培养基，取90mm培养皿分装，每盘内倒入约20mL。（6）待培养基凝固后，进行涂板。每板加入50μL20mg/mLX-Gal与20μL50mg/mLIPTG，混合后涂抹均匀，避光晾干备用。24、转化感受肽（1）连接完成后，将10μL样品全量加入含100μLDH5α感受态细胞的1.5mL离心管内。（2）轻轻混匀后冰上放置30min，42℃金属浴激发90s，冰上冷却2min，操作时避免剧烈晃动。（3）加入900μL不含Ampicillin的LB液体培养基，放入摇床，37℃，150g，培养1h以上。25、养菌待摇床上离心管内菌液长好（充满液体），取100μL菌液滴入凝固的培养基并涂抹均匀。将涂板倒置在摇床内，37℃，避光，保湿，避风，培养12h以上，待菌斑长至直径1mm左右。此时培养基上白斑可用，蓝斑淘汰。可将培养基直接封口，送样测序，也可进一步挑菌培养。26、挑菌用枪头挑取单个阳性克隆菌落混入加有1mL含Ampicillin的LB液