实验三、透明质酸酶的扩散作用

透明质酸酶的扩散作用、

血浆凝固酶实验、内毒素的检测

（鲎实验）

透明质酸酶的扩散作用实验原理透明质酸是葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖聚合物，是一种黏蛋白多糖，有高度的黏性，是结缔组织基质成分，在结缔组织细胞间呈“细胞黏合剂作用”。乙型溶血性链球菌等产生的透明质酸酶可水解透明质酸，使结缔组织疏松，通透性增高，使细菌和毒性物质易于扩散，故此酶亦称“扩散因子”。材料家兔溶血性链球菌24h肉汤培养物滤液墨汁，生理盐水，70%酒精，无菌棉签等无菌注射器、小试管、手术剪、镊子方法和结果方法1，取家兔一只，剪去背两侧的部分兔毛，用70%的酒精消毒。2，分别吸取墨汁和溶血性链球菌培养物滤液的混合液0.1ml和墨汁与生理盐水混合液0.1ml。3，在家兔背两侧分别将刚才的两种各0.1ml的混合液皮内注射（5º-10º，斜面进入，小皮丘。注射时注意：不可使黑色液体漏出）。注射后用标记笔画出黑色的范围，并测量其半径，1h后再测量一次黑色的范围的半径。结果：对比两种混合液扩散的差别，并分析其原因。血浆凝固酶实验

（玻片法）概述葡萄球菌按照有无凝固酶可分为凝固酶阳性菌株和凝固酶阴性菌株，在多数情况下凝固酶阳性葡萄球菌为致病性菌株，而凝固酶阴性葡萄球菌为非致病性菌株。凝固酶作为葡萄球菌的一种毒力因子，其作用是:1,阻碍体内吞噬细胞的吞噬;2,保护细菌不受血清中杀菌物质的破坏；3,与葡萄球菌引起的感染易于局限化和形成血栓有关。实验原理致病性葡萄球菌产生的血浆凝固酶，在某些辅助因子的存在下，使含有枸橼酸钠或肝素等抗凝剂的兔或人血浆中纤维蛋白原变成不溶性的纤维蛋白，使血浆凝固：非致病性葡萄球菌不产生此种酶，因此血浆凝固酶可以用来检测葡萄球菌有无致病性。材料和仪器金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌血平板培养物抗凝兔血浆、生理盐水、毛细滴管、接种环、载玻片等方法和结果方法1，取洁净载玻片一张，于两端各加一滴生理盐水2，用灭菌接种环子血琼脂平板上挑取两种葡萄球菌培养物少许，分别混悬于载玻片的两端的生理盐水中，使其成为均匀的细菌悬液，观察有无自凝现象，然后在每滴细菌悬液中各加入抗凝的兔血浆一滴，混匀。结果数秒钟后观察结果，细菌呈颗粒状凝集为阳性，无凝集则为阴性。内毒素的检测

（鲎实验）区别要点外毒素内毒素来源G+菌,及部分G-菌G-菌存在部分活菌分泌,少数为菌体崩解为细胞壁成分,菌体崩解化学成分蛋白质脂多糖稳定性60-80℃,30min被破坏160℃,2-4h被破坏毒性强,有选择性,引起特殊表现较弱,毒性效应大致相同抗原性强,可刺激机体产生抗毒素,可被制成类毒素甲醛处理不形成类毒素概述内毒素主要生物学活性有：致热作用；白细胞反应；感染性休克；DIC等。需要用来检测内毒素的情况：用来检测所配制的输液用品或生物制品中是否含有内毒素；临床上为了及时地确定患者是否有革兰氏阴性菌感染（内毒素休克）引起的内毒素血症等。检测内毒素的方法有家兔发热法和鲎实验法，家兔发热法比较烦琐，且灵敏度不高，故现在多用鲎实验法，鲎实验法灵敏度高，可检测到10-4μg/ml的内毒素。鲎（hòu），俗称三刺鲎、两公婆、海怪，因其长相既像虾又像蟹，因此人们又称之为“马蹄蟹”,是一类与三叶虫(现在只有化石)一样古老的动物。与它同时代的动物或者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鲎有“活化石”之称。雌雄一旦结为夫妻，便形影不离，经常见到肥大的雌鲎常驮着瘦小的丈夫蹒跚而行。此时捉到一只鲎，提起来便是一对，故鲎享“海底鸳鸯”之美称。

鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提取物——“鲎试剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品工业中，可用它对毒素污染进行监测。原理鲎（hòu）是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种有核变形细胞，这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。内毒素（LPS）

激活凝固蛋白原凝固蛋白（溶解状态）

（凝胶状态）凝固酶原凝固酶BACK材料

鲎试剂鲎试剂溶解水无菌吸管方法及结果方法：1.取三支鲎试剂打开，分别加入0.1ml

鲎试剂溶解水，使之溶解2.其中一支加入0.1ml大肠杆菌内毒素，标记上阳性组，另一支加入