布鲁氏菌病实验研究及生物安全课件

布鲁氏菌病实验研究及生物安全

ResearchProgressofBrucellosisinChinaandControlandPrevention

中国人间布鲁氏菌病疫情

1950-2014年

中国人间布鲁氏菌病空间分布变化

省份2012年2013年

12/13增长速度（%）2014年

13/14增长速度（%）省份2012年2013年12/13增长速度（%）2014年

13/14增长速度（%）

内蒙古124369310-25.141053813.19

云南省2757111.11133133.33

黑龙江省72357169-0.915721-20.22

安徽省2222076245.45

山西省6001708218.01873223.3

湖南省2120-4.7650150

河北省4097537531.19675625.69

福建省1546206.675417.39

新疆2185393079.86749390.66

青海省15118392.3157-51.69

吉林省1931216011.861921-11.06

江苏省1342223.0890114.29

河南省1902330873.92525058.71

贵州省102414062158.33

辽宁省1468212944.93284133.44

江西省91122.2231181.82

山东省649127997.072845122.44

湖北省945400197337.78

陕西省61584837.89149576.3

上海市42-5020

宁夏423903113.482083130.68

四川省38166.6725225

甘肃省129499286.821404181.36

海南省2209350

天津市10617060.3818710

广西121200020-4.76

浙江省88924.551008.7

重庆市143009125

北京市638941.2714461.8

西藏-

2-

-

-

广东省5911086.4419072.73全国395394487713.55851530.392012/2013/2014年布病病例报告分析Amsterdam,TheNetherlands世界卫生组织建议的人布鲁氏菌病诊断世卫组织建议的检测包括：虎红平板试验(RBT)血清凝集试验(SAT)Coomb`s试验补体结合试验(CFT)ELISA荧光偏振布氏菌培养PCR世卫组织未具体确定流程、取舍值和检测特征（诊断灵敏性和特异性）没有明确的阳性和阴性预测值（PPV&NPV）结论取舍值（及灵敏性/特异性）因抗原来源和流程差异而不同，有待优化PPV和NPV取决于疾病的流行程度，有待确立建议开展检测前，应在设计适当的环境中确定诊断功效（灵敏性、特异性、PPV和NPV等）Amsterdam,TheNetherlands虎红平板试验检测特征（流行率低）灵敏度92.9（急性病例）特异性94.3%（无暴露史）

特异性91.7%（重复暴露）

特异性76.9（既往布病患者）

Ruis-MezaetalClinMicrobiolInfect.2005;11(3):221-5不同来源（品牌）和批次的抗原质量差异很大难以解读（弱阳性）由于暴露和非特异性反应，在疾病流行地区的表现不良需要确定取舍值结论诊断功效在很大程度上取决于制剂来源和疾病流行程度，需要确定取舍值血清凝集检测发病后不同月份的灵敏度(%)0-22-44-6>6SAT(1:160)79.564.476.950.62-ME67.119.113.56.01:401:801:1601:3201:6401:1280发现凝集抗体（IgM和IgG)灵敏性随疾病持续时间下降顽固性和布病复发患者中表现不佳在本地流行地区/暴露个体中的特异性较低流行地区的建议取舍值为1：320，提高特异性导致的低灵敏度难以读取和标准化2-ME检测可用于确诊急性病(IgM的指示性滴度降低2倍或2倍以上）布氏菌可被碱性染料着色，如革兰染色为阴性，姬姆莎染色呈红色，布氏菌对染料吸收缓慢布氏菌革兰染色自动培养仪和培养瓶布氏菌生化鉴定血平皿布氏菌菌落布氏菌产生S2H试验BCSP31-PCR引物和扩增片段，产物223bpPrimer1：B45’-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3’Primer2：B55’-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3’检测BCSP31基因的PCR方法，可以在属的水平上检测和鉴定布鲁氏菌菌株OIE推荐鉴定布鲁氏菌种的方法之一

MDL2000DNALadder

1。B.melitensis2.B.abortus3.B.suis4.B.ovis5.B.neotomae6.B.canis

M123456布鲁氏菌属BCSP31-PCR电泳结果

-----223bp

19株标准菌株AMOS-PCR扩增结果

1000bp

123456789101112131415161718

192021222000bp750bp500bp250bp200bp

1、22.DL2000DNALadder2-4.B.Melitensis1-35-11.B.Abortus1-712.B.Abortus913-17.B.Suis.1-518.B.ovis19.B.neotomae20.B.canis21.阴性对照750bp500bp250bp

M1234567891011250bp

223bp

布鲁氏菌属种鉴定1-5AMOS扩增1、c-2、羊13、牛14、猪15、待检菌株

6-10BCSP31-PCR：6、羊17、牛1

8、猪1

9、OVIS10、待检菌株多重PCR(Bruceladder)EvaluationofaMultiplexPCRAssay(Bruce-ladder)forMolecularTypingofAllBrucellaSpecies,IncludingtheVaccineStrains中国分离株的基因型分布省份主ST型菌株数主ST型菌数主ST型比例内蒙古8722636.1%四川811654.5%新疆811545.5%宁夏810660.0%广西217228.6%河南87342.9%山东87571.4%辽宁325240.0%青海85480.0%上海85240.0%安徽40.0%甘肃294250.0%广东84250.0%吉林84375.0%生物安全布氏菌在病原微生物的危害等级划分；

2类属于高致病性实验室适用等级分类：BSL-3其中弱毒株或疫苗株可在BSL-2实验室操作小量标本，初代分离等可以在BSL-2实验室操作血清学检测可以在BSL-1实验室操作注：a大量活菌操作：实验操作涉及“大量”病原菌的制备，或易产生气溶胶的实验操作（如病原菌离心、冻干等）。c样本检测：包括样本的病原菌分离纯化、药物敏感性实验、生化鉴定、免疫学实验、PCR核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动。d非感染性材料的实验：如不含致病性活菌材料的分子生物学、免疫学等实验。生物安全病原微生物实验室感染分析实验室获得性感染（laboratory-acquiredinfection）由于没有监测、报告系统，数据资料不全生物安全包括：实验室实践、实验室设计、个人防护措施和安全设备生物安全美国一份文件统计实验室感染43%由细菌，27%由病毒，15%由立克次体布氏菌是最常见的实验室获得性感染最多的操作是：动物攻毒试验，冻干菌种，强毒株的大量抗原制备等生物安全感染途径吸入、皮肤粘膜污染、摄入等吸入感染很多操作可产生气溶胶，如：感染动物的皮毛、粪便，烧接种环、抽真空、离心、搅拌、研磨等气溶胶≤5um液滴核会悬浮于空中，皮肤粘膜污染：含病原体的液体溅在眼睛、口鼻粘膜及其他皮肤感染摄入感染：误食和不洗手吃食物接种感染

当实验室活动涉及传染或潜在传染性生物因子时，应进行危害程度评估。危害程度评估应至少包括下列内容：生物因子的种类（已知的、未知的或未知传染性的生物材料）、来源、传染性、致病性、传播途径、在环境中的稳定性、感染剂量、浓度、动物实验数据、预防和治疗。危害程度评估应由适当的有经验的专业人员进行。生物安全的评估生物安全设备生物安全柜吸附垫：在操作台上放上贴有吸附材料的塑料薄膜，每日更换，可以把操作台的污染减少到最低程度。柜内实验器材和材料的取出

：生物安全实验室的废弃的污染性材料、使用过的包装材料、容器、纸张等废弃物，都收装好或者经高压灭菌器灭菌后拿到缓冲区：实验中或完毕后，必须从安全柜中取出非灭活的病原体时，应装好放在消毒液槽中，使容器外侧被消毒后取出，消毒液种类因病原体不同而异。

生物安全设备回收容器

：在安全柜内配置回收污染物质的容器：配置存放污染的玻璃器皿和废弃物容器。容器中必须配有消毒液，将污染物质完全浸没。这些回收容器至少每天操作完毕后盖好以防污染。再次使用时需重新清配置消毒液。瓶盖：安全柜内使用的瓶子不用橡胶塞，而用螺旋盖，开启时可减少气溶胶的发生。消毒火焰：用火焰消毒是经典的微生物学操作方法，但是由于会产生气溶胶，并顾虑使柜内气流紊乱，尽量不使用。良好的内务行为应指定专人监督保持良好内务的行为。工作区应时刻保持整洁有序。禁止在工作场所存放可能导致阻碍和绊倒危险的大量物品。

所有用于处理污染性材料的设备和工作表面在每班工作结束、有任何漏出或发生了其他污染时应使用适当的试剂清洁和消毒。对漏出的样本或培养物应在风险评估后清除并对涉及区域去污染。清除时应使用有效的安全预防措施、安全方法和个人防护装备。

良好的内务行为内务行为改变时应报告实验室负责人以确保避免发生无意识的风险或危险。实验室行为、工作习惯或材料改变可能对内务和/