第四军医大分子生物学基因工程

一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

细胞克隆个体克隆（动物或植物）DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)

。目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA技术。重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等逆转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾TaqDNA聚合酶PCR碱性磷酸酶切除末端磷酸基（二）分子克隆实验指南—冷泉港实验室5’---A-G-C-T-A-G-A-A-T-T-C-T-T-A-C-C---3’3’---T-C-G-A-T-C-T-T-A-A-G-A-A-T-G-G---5’限制性核酸内切酶（RestrictionEndonuclease）EcoRIenzymeG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G5’---A-G-C-T-A-G3’---T-C-G-A-T-C-T-T-A-AA-A-T-T-C-T-T-A-C-C---3’G-A-A-T-G-G---5’-OH3’5’P--P5’3’OH-EcoliStrainR#I互补的5’突出末端限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC

G+BamHⅠ细菌限制/修饰体系细菌基因组噬菌体DNAEcoRI甲基化酶EcoRI核酸酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine,1978限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：

Ⅰ型

Ⅱ型*

Ⅲ型限制性核酸内切酶第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。限制性核酸内切酶第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。限制性核酸内切酶第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。限制性核酸内切酶限制酶识别序列特征A5’----3’----TTCGAHin

dIII

A----5’----3’AGCTT5’----CTGCAG3’----G----3’ACGTC----5’Pst

I

5’----AG3’----TCCT----3’GA----5’Alu

I

平末端长度为4~8bp特征为回文结构粘性末端限制性核酸内切酶第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶限制性核酸内切酶同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC

G+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC

G+BstⅠ限制性核酸内切酶同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCC

G++ATCTAG

GATCT

A限制性核酸内切酶https:///products/restriction-endonucleases酶的活性：在适当反应条件下（温度，pH，离子强度），1小时内完全降解1μgλ

噬菌体DNA中所有同一限制内切酶位点所需的酶量定义为1个活性单位。影响核酸限制性内切酶活性的因素(1)DNA的纯度（蛋白质，酚，氯仿，乙醇，SDS，高盐浓度）；(2)DNA的甲基化程度；(3)酶切消化反应的温度；(4)DNA的分子结构；(5)缓冲液的pH值。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶反应体系（15uL）：质粒DNA6uL酶10.5uL酶20.5uLBuffer1.5uLH2O6.5uL限制性核酸内切酶DNA连接酶（DNALigase）催化双链DNA的5’-磷酸末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合

T4DNALigase

，10×T4DNALigaseBufferT4连接酶：连接效率高，既可用于粘端连接，也可用于平端连接。DNA连接酶DNA聚合酶TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine,1959ForthediscoveryofDNApolymeraseI合成双链cDNA分子缺口平移制作同位素标记DNA探针DNA序列分析（一）大肠杆菌DNA聚合酶I（二）Klenow聚合酶Klenowfragment

smallfragment(323AA):having5´→3´exonucleaseactivitylargefragment(604AA):calledKlenowfragment,havingDNApolymerizationand3´→5´exonucleaseactivityNendCendcaroidDNA-polⅠ（三）热稳定DNA聚合酶第一个被发现的热稳定DNA聚合酶：Taq。最初的具有耐热性的DNA聚合酶来自于水生栖热菌（Thermusaquaticus），因此被称为Taq。改善了低效的PCR反应。Taq酶缺乏3‘-5’校正外切酶活性，因此，在复制DNA时有时会出错，造成DNA序列突变（错配），从古菌中获得的Pwo酶及Pfu酶均有校正机制，能够大大降低PCR反应中的突变。将Taq与Pfu结合使用可以保证真实准确得扩增DNA。目的基因的获取方法文库筛选PCR获取化学合成可以获取序列未知基因，操作繁琐获取序列已知基因，操作相对简单合成序列已知的基因HumanDNA文库（Library）（一）基因组DNA文库胰岛素基因生长激素基因血红蛋白基因存在于转化细菌内由载体携带所有基因组DNA的集合问题：如何筛选含目的基因的克隆？文库筛选文库筛选（二）CDNA文库cDNA文库概述

利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。cDNA文库特点

1)时空特异性构建cDNA文库时最好选取目的基因表达量最高的发育时期或这一时期的特殊组织。2)基因特异性来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表正在表达的基因的遗传信息。3）器官特异性有的结构基因的表达就有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同。4）代谢或发育特异性处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同。相对于基因组文库而言，cDNA文库有优点1）特别适用于RNA病毒的基因组结构研究。2）出现假阳性的概率较低。3）有效地分析间断基因的结构。4）发育过程中时间调节基因及组织特异基因的表达特征的分析，都要用到cDNA文库。不足之处1）包含的遗传信息远远少于基因组DNA文库。2）不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外调控序列的结构与功能方面信息。3）在cDNA文库中，高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例较低，分离也比较困难。化学合成已知基因的核苷酸序列，或根据氨基酸序列推导核苷酸序列

一般用于小分子活性多肽基因的合成转化菌筛选鉴定载体DNA

基因组DNA已知基因克隆---PCRβ-globingene

问题：如何在体外大量扩增单基因？Forthe

improvementofthe

polymerasechainreaction

(PCR)technique,TheNobelPrizeinChemistry,1993KaryMullis引物dNTP模板DNA

耐高温

DNA聚合酶PCR反应要素PCR反应过程变性

(95℃,30s）退火（55℃,30s）延伸（72℃,1min）30循环HowtoPerformPCR?“PCR仅仅是实验中的一个小技巧，虽然其中的知识和智慧含量似乎并不丰富，但是毕竟没有人更早的发明它。它对分子生物学的影响远远超过了其他所有的技术”——诺贝尔颁奖典礼AmazingImagination染色体DNA细菌Ori载体DNA（VectorDNA）

载体：指可以携带目的基因进入宿主细胞的运载工具。理想的载体应符合的条件：1.具有自主复制能力，以保证重组DNA在宿主细胞内扩增；2.具有较多拷贝数，易与宿主细胞染色体DNA分开，便于分离提纯；3.分子量相对较小，易于操作，并有足够的接纳目的基因的容量；4.在非宿主功能必须的DNA区段有较多的单一限制性核酸内切酶位点用于目的基因的克隆；5.有一个或多个筛选标记抗性基因Ori目的DNA载体DNA克隆载体抗性基因Ori目的DNA启动子序列表达载体克隆载体——克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，使克隆的DNA片段数量大大增加。表达载体——将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达蛋白质。是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志1.质粒

DNA存在于细菌染色体之外的环状双链DNA分子，可独立自主地进行自我复制可从一个细菌转移到另一个细菌广泛存在于原核细胞，对宿主的生存不是必需的所携带的遗传信息可赋予宿主一些遗传性状，如抗药性按复制方式分类：严紧型，1-10拷贝/细胞;松弛型，10-1000拷贝/细胞载体DNApBR3221977年，FranciscoBolivar克服当时载体的各种缺陷，构建了一个新的载体——pBR322，成为后来几乎所有基因工程质粒载体的祖先。质粒载体的代表，长4.36kb；在细菌中的拷贝数（分子个数）高，便于制备；有数个限制性内切酶的单一酶切位点用于插入外源片段；有四环素Tetr和Ampr两个抗药性基因标记λ噬菌体DNA改造系统（允许插入的外源片段远远超过质粒，感染能力也大于质粒转化细菌的能力，所以一直作为基因组文库和cDNA文库的克隆载体）λgt系列（插入型，允许插入6-8kb，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，允许插入可达30kb，适用基因组克隆，）2.噬菌体(phage)

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列载体DNA酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他载体DNA1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接外源基因与载体的连接BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶16ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接目录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶16ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目录2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体目录4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录导入方式转化(transformation)：

重组载体导入原核细胞转染(transfection)：重组载体导入真核细胞感染(infection)：病毒载体导入细胞重组DNA导入宿主细胞受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

重组DNA导入宿主细胞重组载体导入原核细胞重组DNA导入宿主细胞常用转染方法：1.磷酸钙转染：使DNA形成一种DNA-磷酸钙沉淀物粘附于细胞表面，通过内吞作用被细胞捕获。优点：不需昂贵的仪器和试剂。2.电穿孔：利用仪器产生的高压电脉冲，使细胞膜表面出现微小孔洞，重组质粒可通过这些孔洞进入细胞。优点：操作简单转染效率高3.脂质体转染法：利用脂质体（一种人造类脂膜）携带DNA进入细胞真核细胞表达载体：大多是穿梭载体，有两套复制原点及选择标记，分别在大肠杆菌和真核细胞中作用。重组载体导入真核细胞

1.直接选择法(1)

抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹

2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等重组体的筛选(插入失活法)抗药性标记选择目录抗性基因OriAmpR氨苄青霉素Ampicillin质粒细菌人DNA组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救目录α互补的检测目录原位杂交目录琼脂糖凝胶电泳分离DNA凝胶制备上样电泳染色结果观察琼脂糖凝胶电泳分离DNA凝胶制备——琼脂糖的称量凝胶浓度（％）分辨ＤＮＡ范围（ｂｐ）０.３５０００～６０００００.６１０００～２０００００.９５００～７０００１.２４００～６０００１.５２００～３０００２１００～２０００琼脂糖凝胶电泳分离DNA1.凝胶制备——琼脂糖的熔解加热后加热前琼脂糖凝胶电泳分离DNA1.凝胶制备——冷却凝固琼脂糖凝胶电泳分离DNA2.上样琼脂糖凝胶电泳分离DNA3.电泳琼脂糖凝胶电泳分离DNA4.DNA染色溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳分离DNA5.结果观察表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达克隆基因的表达1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点E.coli表达体系的不足

不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)

很难表达大量可溶性蛋白优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济转染

——将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射

2.真核表达体系

酵母、昆虫、哺乳类动物细胞（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。三、重组技术与医学的关系（二）生物制药

重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱目录基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。（三）基因诊断基本过程区分或鉴定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断标准.能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。（四）基因治疗定义基因治疗(genetherapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式体细胞基因治疗(somaticcellgenetherapy)性细胞基因治疗(germlinegenetherapy)1.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性（五）遗传疾病的预防思考题

Therearemanypossiblebenefitsofgeneticengineeringinhumans,likeendofhunger,cureforallailments,longlife,