一液相色谱基础

液相色谱基础知识色谱的发明人俄国科学家：M.S.Tswett正式命名“色谱”的文献一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱经典液相色谱色谱法简介色谱法（Chromatography）溯源俄国科学加1903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献1906年正式命名（见诸文献）色谱法；Chromatography50年代开始广泛研究和应用主要是气相色谱及薄层色谱高效液相色谱法的广泛应用始于70年代色谱分离的机理色谱是一种分离技术色谱分离是一个物理过程流动相（MobilePhase）固定相（StationaryPhase）样品（溶解于流动相中的溶质）液相色谱分离机理

高效液相色谱是一种以液体作流动相和固体微粒作固定相，待测组分在柱内的两相之间进行高速分配和高效分离的柱液体色谱方法。样品溶液中的各组分，因其物理化学性质的微小差异，当其随流动相进入色谱柱后，便在柱的两相之间产生不同的相互作用力，从而导致柱上迁移速率的微小差异。随着流动相的连续推移，这种微小的差异被不断扩大，直至柱内出现明显不同的迁移距离，使最终达到组分完全分离。什么是液相色谱气相色谱：流动相是气相液相色谱：流动相是液相什么是高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱法，简称：HPLC是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器……广泛应用于各个领域：医药/环保/石化/生命科学/食品及农业……在技术，理论及应用上仍处于发展阶段液相色谱的基本流程图流动相

泵色谱柱检测器

泵输液分离

检测

记录AEGBCDF进样阀进样HPLC的仪器配置色谱泵自动进样器色谱柱及柱温箱检测器数据处理系统溶剂高效液相色谱基本概念＊色谱峰或色谱谱带＊基线噪音＊基线漂移＊检测限（敏感度）＊色谱峰对称性＊色谱定性参数＊色谱柱效能参数液相色谱图相关术语色谱峰－Peak色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线峰底－PeakBase峰的起点与终点之间连接的直线峰高－PeakHeight峰最大值到峰底的距离峰宽－PeakWidth在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半（高）峰宽－PeakWidthatHalfHeight通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离液相色谱图相关术语峰面积－PeakArea峰与峰底之间的面积,又称响应值标准偏差；σ－StandardError0.607倍峰高处所对应峰宽的一半拖尾峰－TailingPeak后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰－LeadingPeak前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰－GhostPeak并非由试样所产生的峰；亦称假峰液相色谱图相关术语基线－Baseline在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线基线飘移－BaselineDrift基线随时间定向的缓慢变化基线噪声；N－BaselineNoise由各种因素所引起的基线波动谱带扩展－BandBroadening由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象液相色谱图相关术语死时间，t0

－Deadtime不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间保留时间，tR

－Retentiontime组分从进样到出现峰最大值所需的时间死体积，V0

－Deadvolume不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积保留体积，VR

－Retentionvolume组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积液相色谱实验所需的基本参数

液相色谱实验所需的基本参数流动相：种类及配比，等度或梯度固定相：色谱柱类型及内径、长短流动相输送系统参数：流速检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等温度控制进样量以上参数即构成一个具体的HPLC方法，亦称色谱条件色谱图：HPLC图形结果

（Chromatogram）色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。←色谱峰保留时间（分）基线↓峰高峰宽响应值色谱峰或色谱谱带流出曲线上的突起部分称为色谱峰正常色谱峰为对称形正态分布曲线不对称色谱峰有两种：前延峰和拖尾峰色谱流出曲线图及相关参数

样品进入色谱柱，经流动相冲洗，由检测器测得的信号-洗脱时间曲线，即色谱图。检测限（敏感度）常用基线噪音的二倍表示：D=2·N/S

式中：

N

为噪音（mV)

S

为灵敏度(mV·ml/g)对称因子计算示意图色谱峰的对称性—对称因子：

a.

拖尾因子

b.

不对称因子峰对称因子计算公式对称因子(fs)：式中：

fs=0.95~1.05为正常峰

fs＜0.95为前延峰

fs＞1.05为拖尾峰色谱柱效能参数计算示意图色谱柱的柱效N理论塔板数计算公式：W s

方法Wtan 16 切线法Wh 5.54 半峰高W3s 9 3sW4s 16 4sW5s 25 5s理论板数(n)计算公式或（通常用）：若应用调整保留时间tR′计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(

n有效或neff

)液相色谱中的相平衡参数

分配系数（K）

容量因子（k）

选择性因子（）分配系数(K)计算公式在一定温度下，系统达到分配平衡时，组分在固定相中的浓度（Cs

)与在流动相中的浓度（Cm)之比：容量因子(k)计算公式

容量因子亦指系统在达到分配平衡后，组分在固定相中的量（Ws）与在流动相中的量（Wm）之比，k=tR-t0／t0

k值

k项

k对分离度影响

00011/2.5022/3.6733/4.751010/11.912020/21.95容量因子k与分离度的关系与R的关系容量因子k

与峰高的关系改变k’

值的方法：调节流动相的极性（比例）、pH、离子强度等梯度淋洗选择性因子()计算公式

两相邻组分的分配系数之比或容量因子之比称为选择性因子（）。要使两组分获得分离，≠1。否则，两相邻组分没有分离。或把

k=tR′／t0代入得：选择性系数a定义∶

a=1时两组分分不开，改变a的途径改变固定相改变流动相（组成）改变温度改变样品的本身性质分离度(R）计算方法示意图分离度(R）计算公式⑴

R=1，称为4

分离，(峰尖间距为4)，两相邻峰基本分离，达95.4%。⑵

R=1.5,为6

分离，分