目的基因的连接转化refresh

实验三、PCR产物的电泳、回收目的基因的连接、转化

实验内容1.PCR产物的电泳、回收；2.PCR产物与T载体的连接3.感受态细胞的制备；4.连接产物的转化；5.铺制LB培养平版；6.涂菌培养过夜。

实验回顾RNA提取RT-PCR目的DNA片段质粒TA载体连接重组质粒目的DNA转化无质粒的E.Coli

死亡有质粒的E.Coli

存活PCR平板筛选一、PCR产物的电泳及回收1）PCR产物电泳：

15ul产物+3ul上样液

1%琼脂糖凝胶，100伏，30分钟。8:10~~9:20预期PCR电泳结果结合片子讲切胶的问题

(不要切引物）2）

PCR产物的回收（挤胶法）

（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放入封口膜中；

（2）将切下来的胶块，标记好姓名，-20℃冰箱中。（3）放在封口膜内直接挤压，用加样器吸取挤压后得到的液体。1、冻融法：1）

在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下,-70oC冷冻至少15min。2）

在65oC水浴中使胶融化，加入等倍体积TE-饱合酚,剧烈振荡30秒钟，然后-70oC冷冻15min。3）

室温融化后，12,000rpm离心5min，将上层水相移至另一管中，用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积3mol/LNaAc(pH5.2)沉淀、漂洗和干燥DNA。

常见回收方法介绍2、挤胶法

（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放入小离心管中；

（2）将切下来的胶块，-70oC冷冻15min；

（3）放在封口膜内直接挤压，用加样器吸取挤压后得到的液体。3、回收试剂盒（商业化）。1）

当回收的片段是用于与载体的连接，准确判断回收片段的DNA含量是非常重要的。将回收得到的片段进行电泳分析，通过与DNAMarker条带的比较，可以粗略判断回收片段的量，为连接反应估计加入多少目的基因片段提供参考，可增加连接效率。2）如何在胶上估计DNA的含量：

DNAmarker参比法。（50ng/5ul）

电泳样本：Marker5ul、T载体1ul、回收片段。电泳后通过判断电泳样品的亮度，大致判断连接片段和载体的比例。回收后鉴定二、PCR产物与T载体的连接

T载体一般是从公司购买的，因此，载体DNA的含量和浓度是已知的。连接反应成败的关键是估计目的DNA的量。可按下列配方进行连接反应：回收的DNA片段7lT载体1lT4DNA连接酶buffer1lT4DNAligase1l终体积10l

轻弹管底混合，离心机甩一下，置25oC水浴1~2h。连接产物可以直接用于转化，也可以置-20oC保存备用。（低温连接效果比室温好）9:20~~9:45TA克隆原理

1、TagDNA

聚合酶的一个功能：使PCR产物的3`端突出一个A。3`

AA3`5`5`3`

TT3`5`5`2、商业设计的T载体：在3`端多出一个T。3、两者的粘性末端可以互补配对。应用时避免反复冻融，防止T的断裂丢失。如果与T载体连接后主要以自身环化为主，要考虑T可能已经丢失。其他说明：1）

连接反应的关键是目的基因片段与载体的比例，一般片段与载体比例为2:1或3:1（摩尔比），根据片段大小决定比例。2）平端连接平端连接通常需要先将载体的5端磷酸去掉，然后再进行连接，这样可以防止载体的自身环化。当载体的5端磷酸去掉后，片段与载体的连接就会留下一个缺口，连接酶由于载体5端缺乏磷酸而无法形成磷酸二酯键，转化入细胞后，细胞内的酶会将缺乏的磷酸基团加上，再形成磷酸二酯键。

三、感受态细胞的制备9:45~10：45

感受态细胞制备原理

培养至对数生长期的大肠杆菌在低渗CaCl2

存在的情况下，细菌变得膨胀而易于外源基因的导入。另外，钙离子溶液处理的细胞对外源DNA的摄取能力增强。说明：1）感受态细胞的膜已经很脆，应该超低温保存。

如果反复冻融会使细胞活力受影响，而且细胞膜的变化可能复原，由感受态细胞状态回转到普通细胞状态，失去接受外源DNA的能力。2）无菌操作。在火焰附近操作，火焰附近是无菌区。各种器具均需消毒。无菌超净工作台

感受态细胞的制备1）将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，置37oC12-16小时。2）

次日从琼脂平板上取一单菌落，于2mlLB培养基中，37oC，225rpm速度震荡培养12-16小时。3）

取1ml上述培养物接种于100mlLB培养基中，37oC，225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(约3小时)。

（上述1－3步骤已经由实验室完成）水浴摇床5）弃上清，除净剩余液体，然后加入100ul

冰冷的100mmol/LCaCl2致敏液悬浮细胞，冰浴5分钟。6）6000rpm，离心5分钟，回收细胞，弃上清，加入100ul冰冷100mmol/LCaCl2溶液，悬浮细胞。7）4oC可保存1-2周；长期保存，可加甘油至终浓度为15%，置-70oC备用。（无菌操作）4）

取1ml菌液冰浴5min，然后6000rpm，离心5min，收集菌体。LB培养基琼脂平板的制备蛋白胨：10g酵母提取物：5gNaCl：10g琼脂：15g蒸馏水：800ml终体积：1L高压灭菌20分钟。学生操作：冷却至50oC，加入抗生素。

铺琼脂平板10:45~~11:00下午实验内容：1、连接产物的转化2、平板筛选4、连接产物的转化

1）将200l感受态细胞置冰上融化，然后加入3lDMSO,混合后，加入10l连接反应液(含重组质粒),

温和混匀，置冰上10分钟。

(目的：防止细胞被胀破。)

2）42oC，45秒，然后迅速放回冰中1-2分钟。13:00~~14:3010l连接反应液一般可以进行2-3次转化

3）加入1mlLB培养液，37oC，225rpm摇荡培养30分钟。4）6,000rpm，离心10秒钟，倒掉上清，用剩余的约200lLB培养液重悬菌体。5）将残存菌液轻轻混匀，铺于含有氨基苄青霉素的LB琼脂培养板上涂匀，室温放置5-10min，倒置于37℃孵箱中培养14-16小时。转化后的平皿面朝下放置：防止水蒸气形成的水滴影响细菌单菌落的形成。转化菌的蓝白筛选基本原理：载体中LacZ基因可编码b-半乳糖苷酶，后者可分解培养物中的X-gal，使其呈