第十三章超氧化歧化酶研究进展4-12

第十三章超氧化物歧化酶研究及应用进展高丽萍20010.4.12一、超氧化物歧化酶的来源、分布及种类二、超氧化物歧化酶的结构、性质、作用机理及其基因的分子生物学三、超氧化物歧化酶的活力测定和生理功能四、超氧化物歧化酶的研究动态、开发应用及存在的问题SuperoxideDismutase

简称SOD,EC1.5.1.1含不同金属离子的氧化还原酶广泛存在于生物界历史与发现1938年，MannheKeilin首次从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋白。当时并不知道它们的性质和作用，以为它是金属的储藏库。

1969年，Mccord和Fridovich因其能催化超氧阴离子的歧化反应，而将其命名为超氧化物歧化酶。主要作用：专一地去除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基。医药---预防或治疗由超氧阴子自由基引起的多种疾病，是一种很有用途的酶。生物领域---抗病与抗衰老食品---功能性食品一、SOD的来源、分布及种类1、来源与分布广泛存于生物界的金属酶类，是生物体防御活性氧毒害的关键蛋白质。Keele等推测，在所有需氧细胞包括最简单的微生物体内，都可能含有。1973年，Bell等发现厌氧菌硫酸还原菌中有SOD活力，以后在多种专性厌氧菌中都发现其存在，只是活力很低，不易检测。侯金泉等考察发现蚯蚓、葡萄、大蒜及一些保健饮料中含量丰富。迄今为止，人们已从细菌、真菌、原生植物、藻类、昆虫、植物、两栖动物和哺乳动物（有氧呼吸生物体内）中分离提纯得SOD。含量最丰富的是动物的肝脏组织、血液。含SOD较高的天然植物有大蒜，韭菜、大葱、油菜、柠檬和番茄等也含有。微生物中SOD含量与该菌的需氧程度和耐氧能力有很大关系，一般菌体耐氧能力强，其SOD含量就高。真核微生物的SOD含量高于原核生物，好氧微生物显著高于厌氧微生物。2、分类根据SOD所含金属辅基的不同，一般可将其分为Cu/ZnSOD、MnSOD、FeSOD三种类型。Cu/ZnSOD是真核生物酶。主要存在于真核细胞的细胞质和叶绿体的基质中，动物血肝、奶、植物叶、果等均含有。MnSOD和FeSOD是原核生物酶。MnSOD主要存在于原核细胞、真核细胞以线粒体基质中FeSOD主要存在于原核细胞及少数植物中。二、超氧化物歧化酶的结构、性质、作用机理及其基因的分子生物学（一）、SOD的结构1、Cu/ZnSOD分子结构为二聚体或四聚体，亚基分子结构由β-折叠组成，几乎没有α-结构，分子量为32000-65000。三维结构由2个基本相似的亚基组成的二聚体，每个亚基的分子量为16KD，150个氨基酸残基，含有一个铜原子和一个锌原子。两个相同亚基之间通过非共价键的疏水相互作用而缔合，类似于圆筒的端面。2、MnSOD和FeSODMnSOD和FeSOD一般为二聚体或四聚体，每个亚基的分子量约为23KD，含0.5-1.0个Fe原子。它们在空间结构上与Cu/ZnSOD不同，含有较高程度的α-螺旋，而β-折叠较少。（二）、SOD的作用底物和作用机理交联聚合脂质过氧化物蛋白质导致胶原坚硬、长度缩短、失去膨胀力不溶性蛋白质皱纹和老年斑是如何产生的？氧自由基多价不饱和脂肪酸丙二醛与磷脂酰乙醇胺交联氧化酶黄色色素棕褐色色素与蛋白质、胺类或脂类结合（三）、SOD的性质1、基本性质特征MnSOD和FeSOD性质相似，它们与Cu/ZnSOD在蛋白质一级结构，空间结构，分子量，光谱性质等方面差别较大。Cu/ZnSOD呈蓝绿色，分子中的铜为二价，紫外、可见特征吸收峰在250nm、680nm。

MnSOD呈紫红色（粉红色），特征吸收峰在280nm、475nm。FeSOD呈褐色（黄），特征吸收峰在280nm、350nm。2、热稳定性对热表现出异常的稳定性。在55℃/15~30分钟，60℃/10~25分钟或65℃/10~15分钟的条件下，酶活性的变化不大。加热至75℃时，其酶活性几乎不会丧失。在离子强度非常低时，即使加热至95℃其酶活性丧失亦很小。牛红细胞中Cu-Zn-SOD的Tm为83℃室温下保藏9个月，酶活存留率为60%；保藏一年为51.2%。SOD的热稳定性有种族差异，如大鼠肝中的Mn-SOD不耐热，但人肝和鸡肝的Mn-SOD却很耐热。3、pH的影响天然的Cu-Zn-SOD在pH3.6时，95%的Zn会脱落，pH<6.0，Cu的结合位点要移动，pH>12.2时酶的构象会发生变化，但总的来说，SOD对pH并不敏感，通常pH5.3～9.5范围内对酶活性影响不大4、对氰化物、H2O2的敏感性Cu-Zn-SOD活力受KCN、H2O2抑制Mn-SOD活力不受KCN、H2O2抑制Fe-SOD活力不受KCN、受H2O2抑制临床诊断肿瘤细胞内的Mn-SOD要比正常低得多5、金属辅因子Cu-Zn-SOD中Zn仅与酶分子的结构有关，而与催化活性无关，Cu与催化活性有关，透析去Cu，酶活全部丧失，重新加入，活性恢复。Mn和Fe与Cu一样分别对Mn-SOD和Fe-SOD的催化活性具有作用。6、变性剂和还原剂变性剂：尿素、SDS和EDTA。牛血SOD在含SDS、EDTA的6M尿素溶液加热活性丧失，但在8M尿素溶液中相当稳定。还原剂：巯基乙醇导致酶活性的降低巯基乙醇作用于-SH或二硫键，当加入后SOD就会解聚。这已在人、牛和麦胚中的Cu-Zn-SOD中得到证实。7、电离辐射电离辐射会产生超氧阴离子，SOD能清除超氧阴离子，SOD具有抗辐射作用。SOD通过辐照后，除酶本身活性降低外，许多理化性质如电子图谱、紫外吸收、电子核磁共振以及铜、锌的含量等都会改变。Mn-SOD和Fe-SOD经电离辐射后，金属辅助因子Mn和Fe会脱落，导致酶活性的丧失。(四）、SOD基因的分子生物学目前,在基因库中已经登记的SOD基因已有上千个,来自各种微生物、动物和植物等,并有多种SOD已经在大肠杆菌、酵母等载体中得到表达,在植物中也得到多种SOD的cDNA克隆并转化成功了不同的植株,获得了SOD活性增强转基因植株。通过对转SOD基因种子的水培试验,发现转基因烟草植株能在叶绿体中过量表达FeSOD,在叶绿体和线粒体中过量表达MnSOD,其SOD活性都比没经转化的对比植株高许多。三、超氧化物歧化酶的活力测定和生理功能（一）、SOD的活力测定SOD活性在糖尿病和慢性肾功能不全与正常者间有显著差异；吸烟者红细胞SOD含量均较非吸烟者低.可见，适宜的SOD活力测定方法具有重要的现实意义。1、直接法脉冲辐射分析法，截流光谱分析法，极谱氧电极法和极谱法，可直接获得SOD催化反应的动力学信息，测定反应过程中SOD浓度的变化。因受试剂和仪器的限制，此类方法一般难于在实验室推广。2、间接法由于SOD的作用底物是O2¯，它的存在寿命很短，而上述直接法又不能得到普遍推广，因此一般常用间接的活力测定方法。此类方法有经典的邻苯三酚自氧化法，改良的邻苯三酚自氧化法，四氮唑蓝法，肾上腺素自氧化法、联二茴香胺法以及黄嘌呤氧化酶法，化学发光免疫法等。2、间接法原理是：有一产生O2-的系统，使O2-再产生一个便于检测的反应，通过监测SOD对这个反应的抑制程度，间接测定SOD活力。O2-+羟胺→亚硝酸盐+显色剂→紫红色2O2-→H2O2(SOD存在时)（二）、SOD的生理功能A.SOD是特殊的氧自由基清除剂B.明显的防晒效果，可有效防止皮肤受电离损伤；C.有效防止皮肤衰老，祛斑，抗皱，起抗氧化酶的作用。D.明显的抗炎作用，对皮肤病有一定的疗效。四、超氧化物歧化酶的研究动态、开发应用及存在的问题（一）、SOD的研究动态

1、结构性能改造：①SOD酶半衰期短，室温下通常只有6—10分钟（min）；②分子量约32000道尔顿，不易透过细胞膜；③如果口服，易受蛋白酶水解而失去活力；④每人身体接受外源性SOD的差异。这些问题往往主要通过SOD的化学修饰来解决。

SOD化学修饰的方法①对SOD的氨基酸残基进行化学修饰,主要是对非活性部位进行修饰,目的是提高其稳定性同时保留较高的生物活性②用水溶性大分子(如聚乙二醇、聚蔗糖、右旋糖酐和聚烯属烃基氧化物等)对SOD进行共价修饰以提高酶学特性③对SOD进行酶切改造,降低相对分子质量、减小抗原性。研究表明:化学修饰后SOD基本上保持了天然酶的活性,在耐热、耐酸碱和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。2、SOD模拟研究——活性中心模拟谢英等人合成了以二肽为配体的铜2(N2正十二碳酰双甘肽)配合物,这是一个带功能基的长链铜(Ⅱ)氨基酸配合物,同时用脉冲辐解法测定了其SOD活性,较好地模拟SOD毛宗万等人研究了具有Cu/Zn-SOD酶活性中心类似结构的模型化合物,结果表明,咪唑桥N原子沿四方锥配位底面位置与Cu(Ⅱ)配位的模拟物活性大大高于咪唑桥N原子沿四方锥轴向与Cu(Ⅱ)配位的模拟物-----SOD模拟物具有相对分子质量小、稳定性高、在体内半衰期长及脂溶性好的优点(二)、SOD的应用1、应用研究—SOD与顺铂的肾毒性Cis-[Pt(NH3)2C12]十H2O→Cis-[Pt(NH3)2(H2O)2]2+十2C1-氧化应激在顺铂所致肾毒性中的作用

(二)、SOD的应用

1、SOD在临床上的应用当机体超氧阴离子自由基产生过多或SOD浓度偏低时，过量的超氧阴离子就会引起疾病，补充外源性SOD可有效地予以防治。作为第一个以超氧阴离子自由基为其作用底物的酶被发现以来，已充分证明了其在防治与超氧自由基有关的疾病的作用是有效的。由于SOD是生物体内存在的酶，安全无副反应，也很少出现过敏症状。欧美国家已于1988年批准它作为一种临床治疗药物。已在化妆品、牙膏和功能性食品中得到广泛应用。临床应用范围：A.延缓衰老，清除自由基，阻止自由基连锁反应。B.治疗炎症疾病。C.治疗肿瘤和癌症。1995年报道，美国生产的牛血SOD冻干注射剂（商品名奥固肽，Orgotein)已被美国FDA指定为治疗与SOD突变有关的家族性肌萎缩性侧索硬化的药物，临床有效，无副作用。目前，该药物已由美国进口我国，4mg/支，临床主要用于类风湿关节炎，放射性膀胱炎，也用于骨关节炎。在台湾有人将0.1%的SOD凝胶局部应用于二至三度烧伤，每日使用两次，连续7天。结果显示能非常显著地加速创伤表皮的再生和创伤的愈合。2、SOD在食品工业上应用作为抗衰老功能食品的添加剂，如制成强化SOD的牛奶、饮料、口香糖等系列产品。在食品保健业中，目前已渗入超氧化物歧化酶的有蛋黄浆、中老年奶粉、可溶性咖啡、啤酒、SOD口服液等。作为抗氧化剂，抑制过氧化酶的作用，如用于果蔬采后保鲜。3、SOD在化妆品上的应用明显的防晒效果，可有效防止皮肤受电离损伤；有效防止皮肤衰老，祛斑，抗皱，起抗氧化酶的作用。长期使用可使皮肤富有弹性和光泽，青春常驻添加SOD化妆品种类有：化妆水、露、霜、洗面乳、沐浴液、护发素等系列化妆品。4、SOD在农业上应用动物上：应用SOD有报道，北京农业大学用SOD制剂喂养艾维因鸡苗，检测结果鸡血液中SOD酶活提高21.6％，增重5％，LgG（抗体）水平、球蛋白水平均高于对照，屠宰率和鸡肉质量均有明显提高。其他在肉牛、草鱼、对虾的养殖上均获得类似的结果。植物上：研究SOD与植物生长发育、植物抗逆性、抗病性及抗衰老等方面研究的较多。最早是中国农业大学梅汝鸿等人在研究增产菌时，发现增产菌中某些菌株（内生共生芽孢杆菌）进入油菜、水稻、棉花、甘薯等等作物体内，植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性明显增加，在电泳谱带上表现出凡用增产菌者，酶谱谱带新增1－2个带，同时谱带明显加宽。增产菌剂量加大，SOD酶活量也增加。

1986年开始，中国农业大学将益微（增产菌）中超氧化物歧化酶（SOD）纯化提取出来，形成制剂、制品、粗酶、精酶、结晶等五个层次益微SOD产品。产品方向：

1、酶结构、性质及基因研究，构建高产SOD工程菌。2、医用治疗剂、防衰老保健剂。3、食品添加剂；4、保健化妆品；5、畜禽治疗剂。6、饲料添加剂；7、高酶菌；8、菌酶合剂。9、绿色食品；10、促生剂、抗性诱导剂。

中国农业大学梅汝鸿等人首先将益微SOD用于开发“天然绿色保健功能食品”，现称“天然功能食品”。已经开发的有SOD草莓、SOD苹果、SOD猕猴桃、SOD猕猴桃果汁、SOD甜瓜、SOD西红柿、SOD龙眼等。某些产品为国内外首创，注册了商标，如“岭南SOD龙眼”，申请了国家专利[专利申请号：99310754·0]。

我国已开发SOD产品主要单位及来源

SOD来源SOD金属离子

单

位牛血Cu、Zn军事