(4) 絮凝沉淀技术

沉淀技术赵林12生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(沉淀/超过滤/萃取)纯化(层析、离子交换、吸附)脱盐(凝胶过滤、超滤)浓缩(超滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性4破碎方法介绍1.机械破碎法2.物理破碎法3.化学破碎法4.酶学破碎法1机械破碎51.高压匀浆破碎2.珠磨破碎3.喷雾撞击破碎4.超声波破碎机械破碎（1）高压匀浆6m/s50-70MPa剪切力（2）珠磨7（3）喷雾撞击破碎高速冻结、微小粒子、高速载气8（4）超声波由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。9在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation），空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。2物理破碎（1）温度差破碎法冻结（液氮）-融化（50-60℃）

低温冷冻一方面能使细胞膜的疏水键结构断裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶使细胞内外溶液浓度发生变化，引起细胞突然膨胀而破裂。10（2）压力差破碎法渗透压冲击将细胞先放入高渗透压的介质中，如高浓度的甘油或蔗糖溶液，在达到平衡后，介质被突然稀释，或将细胞转入水中或缓冲液中，水就会迅速进入细胞内，致使细胞膨胀，引起细胞壁的破裂.此法适用于细胞壁比较脆弱的，或者细胞壁预先用酶处理过的，或细胞壁合成受到抑制的微生物。

在各种细胞破碎法种是最为温和的一种。11(3)干燥破碎

干燥破碎可采用空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。

干燥过程能使细胞膜渗透性改变，再用丙酮、丁醇或缓冲液等处理时，胞内物质就容易被抽提出来。123化学破碎法原理：化学试剂改变或破坏细胞壁膜结构常用试剂：碱液、有机溶剂、表面活性剂13有鲜明的优缺点4酶学破碎法外加酶制剂或自溶法（1）释放出克隆的胞内蛋白（2）制取特殊的壁葡聚糖聚合物（3）与机械细胞破碎法协同使用（4）从细胞内不同位置选择性地释放产物14沉淀precipitation

是利用沉淀剂使目标产物或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体凝聚物（aggregates）的过程。15沉淀操作常在发酵液经离心或过滤除去不溶性杂质及细胞碎片以后进行，得到的沉淀物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶等。一、沉淀技术概述沉淀技术的特点16沉淀过程中析出的固相成分较复杂：除含有目标分子外，还夹杂共存的杂质、盐和溶剂。沉淀属于粗分离操作。沉淀技术具有简单、经济和浓缩倍数高的优点。沉淀分离具有选择性，可以有选择地沉淀杂质或目标产物。沉淀生物活性物质时需注意沉淀剂或沉淀条件是否会破坏活性；是否有毒；是否易除去。沉淀技术的应用17沉淀分离技术广泛应用于抗生素、有机酸等小分子物质和蛋白质、多糖、核酸等大分子物质的分离。通过沉淀技术可以达到产物浓缩的目的。沉淀可以将已经纯化的产品由液态变成固态加以保存或进一步处理。沉淀可以进行间歇或连续操作。应用沉淀技术应考虑的因素沉淀的方法和技术应具有一定的选择性，以使要分离的目标成分得以很好的分离。（选择性越好，纯度越高）对于酶类和蛋白质，除了选择性之外，还需要注意沉淀方法对目标成分活性和结构的破坏作用。对用于食品和医药中的目标成分，还需要考虑沉淀剂残留对人体是否有害。18沉淀技术的分类金属盐沉淀法盐析法等电点法有机溶剂法选择变性法非离子多聚体法生成盐复合物法其它方法19沉淀操作的基本步骤20待处理溶液加入沉淀剂沉淀物的陈化（沉淀析出）收集沉淀离心或过滤收集上清一金属盐沉淀法原理：利用金属离子与酸根在形成盐类时溶解度低而进行的分离操作。柠檬酸工业生产柠檬酸有温和爽快的酸味，普遍用于各种饮料、汽水、葡萄酒、糖果、点心、饼干、罐头果汁、乳制品等食品的制造。柠檬酸属于果酸的一种，主要作用是加快角质更新，常用于乳液、乳霜、洗发精、美白用品、抗老化用品、青春痘用品等。化工、纺织医药环保禽畜生产2122中和酸解沉淀法从发酵液中提取柠檬酸2C6H8O7•H2O+3CaCO3------Ca3(C6H5O7)2•4H2O+3CO2+H2OCa3(C6H5O7)2•4H2O+3H2SO4+H2O-----2C6H8O7•H2O+3CaSO4•H2O谷氨酸+Zn+锌盐法钙盐法谷氨酸+Ca2+谷氨酸23二盐析沉淀技术盐析salting-out

指生物大分子等物质在高浓度中性盐的水溶液中溶解度降低而发生沉淀。24盐析法的优点：

成本低；操作简单、安全；对许多生物活性物质稳定。许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等。25蛋白质的各级结构氨基酸一级结构二级结构三级结构四级结构血红蛋白2627疏水作用力氢键作用力离子键作用力二硫键Cys-SH-----HS-CysCys-S—S-Cys1、蛋白质盐析的原理分子直径：1—30nm相对分子量：5×103—1×106u28蛋白质分子以亲水胶体形式存在于水溶液中。（1）蛋白质为两性电解质，在一定pH下带一定电荷，静电斥力使分子相互排斥。（2）蛋白质分子周围的水化层防止蛋白质凝聚沉淀。29双电层30蛋白质分子双电层紧密层分散层带电粒子的静电相互作用取决于ζ电位的大小。分散层厚度越小，ζ电位越小蛋白质外围结构：双电层、水化层。31ζ电位是一个表征分散体系稳定性的重要指标。

由于带电微粒吸引分散系中带相反电荷的粒子，离颗粒表面近的离子被强烈束缚着，而那些距离较远的离子形成一个松散的电子云，电子云的内外电位差就叫作ζ电位。ζ电位盐析法机理（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。（3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。溶解度和离子强度的关系水溶液中蛋白质的溶解度一般在生理离子强度范围（0.15~0.2mol/kg）时最大。当离子强度较高时，溶解度的对数与离子强度之间呈线性关系。33Cohn方程：logS=β-ksIS

蛋白质溶解度g/L

β

常数，取决于溶质的性质，多为经验数据。

ks盐析常数

I离子强度

mol/Lks盐析常数主要取决于加盐的性质，ks大小与各种离子价数成正比，与离子半径及溶液的介电常数有关。多价阴离子，如硫酸根和磷酸根有较高的ks蛋白质的盐析常数会受到溶液pH和温度的影响。34蛋白质NaClMgSO4(NH4)2SO4Na2SO4磷酸盐柠檬酸钠β-乳球蛋白0.63马血红蛋白0.330.710.761.000.69人血红蛋白2.00马肌红蛋白0.94卵清蛋白1.22纤维蛋白原1.071.46一些蛋白质的盐析常数2、盐析方法的分类在一定pH和温度下，改变离子强度的盐析叫ks分段盐析法；适用于早期粗分离。在一定离子强度下改变pH和温度的盐析叫β分段盐析法；适用于后期的进一步分离提纯。353、影响盐析的因素（1）蛋白质浓度的影响

logC1=β-ksI1logC2=β-ksI2logC1/C2=ks（I2-I1）36几点结论不同浓度的蛋白质盐析所需盐浓度不同，高浓度蛋白质可以节约盐的用量。蛋白质浓度太高时，由于一些蛋白质的β、ks常数相近，会发生严重的共沉作用。蛋白质浓度太低时，所用盐的量较多，但发生共沉作用少。分步分离提纯过程中，宁可控制蛋白质浓度低一些，多用一些盐，以取得好的分离效果。蛋白质浓度一般控制在2.5-3.0%较合适。37（2）离子类型和离子强度的影响38常见阴离子盐析作用顺序：PO43-〉SO42-〉CH3COO-〉Cl-〉NO3-〉ClO4-〉I-〉SCN-常见阳离子盐析作用顺序：Al3+〉H+〉Ba2+〉Ca2+〉NH4+〉K+〉Na+〉Mg2+分步盐析不同蛋白质发生盐析时所需求的离子强度是不同的。一般从低离子强度到高离子强度顺序进行分步沉淀。39纤维蛋白原假球蛋白血清白蛋白C血红蛋白肌红蛋白盐析用盐的基本要求40溶解度大，能配制高离子强度的盐溶液；盐析作用强，一般多价阴离子较强，而多价阳离子容易使盐析作用降低；溶解度受温度影响小，便于在低温下操作在生物学上惰性，不能影响蛋白质的分子活性，而且尽量不引入分离和测定的新杂质。盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀的沉降和离心分离。来源丰富、经济，常用盐有硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。（3）pH对盐析的影响一般而言，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变pH可以改变蛋白质的带电性质，即可改变蛋白质溶解度。414243（4）温度对盐析的影响

在低离子强度下，蛋白质溶解度在一定范围内一般随着温度增加而增加。在高离子强度下，蛋白质类生物大分子随温度的升高溶解度常常降低。一般情况下，蛋白质盐析对温度的要求不严格，在室温下进行即可；对温度敏感的酶，要在0-4度下操作，以免失活。44COHbTCIC454、盐析沉淀技术的操作盐析常用盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁；磷酸钠、磷酸钾；氯化钠、氯化钾；醋酸钠、柠檬酸钠、硫氰化钾等。硫酸铵优点是溶解度比较大，而且受温度影响较小；缺点是缓冲能力弱，含氮原子对蛋白质分析有影响。硫酸钠是不含氮原子对蛋白质分析没有影响；缺点是30度以下溶解度较低，30度以上效果较好。盐的种类盐析作用溶解度溶解度受T影响缓冲能力其他性质硫酸铵大大小小含氮、便宜硫酸钠大较小大小不含氮、较贵磷酸盐小较小大大不含氮、贵硫酸铵盐析操作（1）硫酸铵使用前的预处理46选择硫酸铵纯度级别：粗分离采用三级纯度的生化工业用的硫酸铵；对于蛋白质或酶的分离，要用纯度较高或经过重结晶的硫酸铵。除去重金属离子：将硫酸铵配成溶液，通入硫化氢至饱和，放置过夜，过滤除去重金属离子，滤液蒸发浓缩结晶，在100度下烘干。调pH：高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（pH约为5），适用前用氨水或硫酸调至所需的值。47（2）饱和硫酸铵的配制及调整固体加入法：将硫酸铵磨碎成细粒，在搅拌下分批缓慢加入溶液中。当盐析要求饱和度较高而又不增大溶液的体积时，多用此法。饱和液法：取过量硫酸铵加热（50度）搅拌溶解，保温10分钟，趁热滤去不溶物，放置过夜，第二天有少量硫酸铵析出即达到100%的饱和度。盐析时所需加饱和液的体积V=V0（S2-S1）/（1-S2）透析平衡法：先将待盐析的样品装于透析袋内，然后进入饱和硫酸铵溶液中进行透析，硫酸铵逐步进入袋内达到盐析饱和度，产生沉淀。4849盐析所需饱和度的试验确定：如图所示，沉淀目标蛋白的用盐饱和度范围为35%-55%具体值应根据同时得到较大纯化倍数和回收率而定。5051目标蛋白来源硫酸铵饱和浓度收率纯化倍数一次沉淀二次沉淀人干扰素细胞培养液30（上清液）80（沉淀）991.7白细胞介素2细胞培养液35（上清液）85（沉淀）73.57.0组织纤溶酶原激活物猪心抽提液50（沉淀）751.8蛋白质盐析沉淀实例52（3）硫酸铵盐析需注意的问题加固体硫酸铵时，要看清表上的温度要求。分段盐析时，要考虑每次分段后蛋白质浓度的变化，以调整不同的盐析饱和度。盐析后一般需要放置半小时至1小时，待沉淀完全后再进行过滤或离心，过早的分离会影响收率。低浓度的硫酸铵溶液盐析后固液分离常采用离心，高浓度的硫酸氨常采用过滤。为获得试验的可重复性，盐析条件，如温度，pH，硫酸铵的纯度都要严加控制。53100ml血清+100mlPBS滴加200ml饱和硫酸铵pH7.2上清液含清蛋白（Ab）沉淀溶于PBS，定容100ml沉淀含纤维蛋白质上清液上清液沉淀主要含γ-球蛋白和少量β-球蛋白上清液为α-球蛋白及小量清蛋白及β球蛋白沉淀主要为β-球蛋白溶于PBS中定容100ml上清液为β-球蛋白沉淀主要为γ球蛋白溶于PBS中定容100ml上清液沉淀主要为γ-球蛋白滴加饱和硫酸铵至45%饱和度上清液为α-球蛋白及小量清蛋白及β-球蛋白沉淀主要为β-球蛋白滴加饱和硫酸铵至20%饱和度滴加饱和硫酸铵至30-33%饱和度滴加饱和硫酸铵至45%饱和度滴加饱和硫酸铵至30-33%饱和度滴加饱和硫酸铵至30-33%饱和度等电点（PI）：溶液中蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液的pH影响。54三、等电点沉淀技术稳定稳定55StructureofthepentapeptideSer-Gly-Tyr-Ala-Leu.NterminusCterminusProteinstructure56“Acidic”aminoacids

:containingadditionalcarboxylgroupswhichareusuallyionizedasparticacid

(Asp,D，天冬氨酸)glutamicacid(Glu,E，谷氨酸)57“Basic”aminoacids:

containingpositivelychargedgroupsLysine(Lys,K,赖氨酸)Aimidazolegroup(咪唑基)Arginine

(arg,R,精氨酸)deaguanidinogroup(胍基）Histidine

(His,H，组氨酸)58--------++++++++pH=pIpH>pIpH<pI等电点沉淀法是利用两性电解质分子在等电点时溶解度最低，而各种两性电解质具有不同的等电点来进行分离的一种方法。蛋白质、酶、核酸等生物大分子和氨基酸、核苷酸等生物小分子可以用等电点沉淀法分离。等电点沉淀法的应用等电点沉淀需要在低离子强度下调整溶液的pH至等电点，可用盐酸、磷酸、硫酸等。在等电点的pH值下利用透析等方法降低离子强度，也可使蛋白质沉淀。等电点法常需要和其它沉淀法联合使用。常用于除去杂蛋白。如果沉淀操作时pH过低或过高，容易破坏目标产物的活性。59生物大分子的等电点易受盐离子的影响而发生变化：（1）若蛋白质结合钙镁锌等阳离子多，则等电点升高；（2）若蛋白质结合HPO42-

、SO42-

、Cl-等阴离子多，则等电点降低；（3）自然界中许多蛋白质较易结合阴离子，使等电点向酸侧移动。例如，胰岛素等电点为5.3，与锌离子结合后，形成胰岛素锌盐，其等电点变为6.2。60概念：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。原理：（1）加入亲水性有机溶剂后介质的介电常数降低

根据库仑定律：k:库伦常数q:粒子所带电量r:粒子间距离F：作用力

ε:介电常数61四、有机溶剂沉淀技术溶质分子之间的静电引力增加。62（2）亲水性有机溶剂本身的水和作用，降低了水活度，使溶质分子表面原有水化层的厚度减小，导致脱水凝集。脱水作用较静电作用占更主要的地位。水的活度：食品中自由水,可利用水,或者说活性水的含量。近似等于食品在密封容器内的水蒸汽压（P）与在相同温度下的纯水蒸汽压（Po）之比。A：水的活度值；P:溶剂的蒸汽压；P0：纯水的蒸汽压大多数细菌在水活度低于0.91的条件下无法繁殖,而霉菌就可以耐受比较低的水活度环境,大致在0.61-0.94之间有机溶剂沉淀技术的优缺点：优点（1）分辨率高于盐析，即一种生物大分子溶质只有在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。（2）沉淀产品不需要脱盐，采用过滤和挥发的方法可以去除有机溶剂，而且有机溶剂，沸点较低，便于回收。缺点容易造成生物活性分子的变性失活，常需在低温下操作。63有机溶剂沉淀的影响因素1、温度（1）蛋白质、核酸类生物活性大分子在有机溶剂中对温度特别敏感，加入的有机溶剂需预冷至较低温度（-10~-20度）。（2）核苷酸、氨基酸、生物碱、糖类等分子对温度要求不太苛刻，但低温有助于提高沉淀效果。64652、样品浓度（1）低浓度的样品使用有机溶剂的量大，但是共沉作用小，分离效果好。样品损失较大（即回收率小），具有生理活性的样品容易产生稀释变性。（2）高浓度的样品使用有机溶剂的量小，但是共沉作用大，分离效果差。样品损失较小（即回收率高），具有生理活性的样品变性危险小。（3）一般而言，蛋白质的相对分子量越大，有机溶剂沉淀越容易，所需的有机溶剂量越少。（4）样品浓度经验值，蛋白质：5-25mg/mL

粘多糖：1-2%66pH值（1）在样品结构稳定的前提下，选择溶解度最低处的ph值（pI），有利于提高分离效果。（2）适宜的pH可以提高分离的分辨率。例如：糖蛋白绒膜激素（HCG）的提取蛋白质（浓度1%）加乙醇至浓度55%加乙醇至浓度66%部分HCG沉淀加入一定醋酸铵调整pH=5.7

HCG67离子强度对于蛋白质和多糖，在有机溶剂中盐的浓度一般为0.01-0.05mol/L，不超过5%比较合适。使用乙醇的量不超过两倍体积为宜。金属离子的影响一些锌钙等阳离子可以在一定PH下，使呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，既不影响活性，还可以提高沉淀程度，在工业上有很实用的价值。

注意：事先除杂蛋白；避免形成磷酸锌沉淀。68有机溶剂的选择介电常数小，如丙酮（22）、乙醇（24）、甲醇（33）对生物分子的变性作用小毒性小，挥发度适中一般需要与水无限混溶。69乙醇：具有沉淀作用强，沸点适中，无毒等优点，广泛用于沉淀蛋白质、核酸、多糖及核苷酸、氨基酸等。丙酮：沉淀作用大于乙醇，但具有沸点较低，挥发大，对肝脏有毒性，易燃等缺点。甲醇：沉淀作用与乙醇相当，但对蛋白质的变性作用比乙醇，丙酮都小，由于毒性大，也没于广泛使用。沉淀有机物分子沉淀金属离子常见的螯合剂和络合剂：具有—C=N-OH结构，能与二价金属离子形成螯合物。如水杨酸肟。如邻氨基苯甲酸等芳香族化合物能与Cu2+、Zn2+、Cd2+、Fe3+等形成络合物而沉淀。其他螯合剂或络合剂有偶氮类化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉、联苯胺、吡啶等，由于其具有强毒性甚至致癌性，并且具有异味，不能使用。羟基肟类：氨基酸类：70有机溶剂浓度的计算：

v

加入100%浓度有机溶剂的体积

V0原溶液体积

S1原溶液中有机溶剂的浓度

S2所要求达到的有机溶剂浓度71有机溶剂添加量计算公式：7212%右旋糖酐上清液37.5-38.5%乙醇沉淀分子量18万以上右旋糖酐上清液上清液上清液沉淀沉淀沉淀分子量4.5-7万以上右旋糖酐分子量2.5-4.5万右旋糖酐分子量1-2.5万右旋糖酐38.5-42.5%乙醇45%乙醇60%乙醇右旋糖酐的有机溶剂沉淀分离73２、有机沉淀剂根据形成沉淀反应机理的不同，一般可将有机沉淀剂分为

螯合物型离子缔合物型三元络合物型。7475Ⅰ．类型：（1）螯合物型有机沉淀剂螯合物型的沉淀剂种类最多，8一羟基喹啉及其衍生物、丁二酮肟、铜铁灵、新铜铁灵、铜试剂、苯肼酸及其衍生物，芳香族氨基酸、苯异三唑等。8一羟基喹啉-M丁二酮肟-Ni铜铁灵、新铜铁灵铜试剂（DDTC)与二价金属离子生成螯合物77（2）离子缔合型有机沉淀剂缔合型有机沉淀剂有：苦杏仁酸及其衍生物，二苦胺，四苯硼酸钠及联苯胺，氯化四苯肼等。78（3）三元络合物有机沉淀剂能形成三元络合物沉淀的有机沉淀剂较少，例如：吡啶在SCN－存在下，可与Ca2+、Co2+、Mn2+、Cd2+、Zn2+等离子形成三元络合物沉淀；在Cl-存在下，1,10—邻二氮杂菲与Pd2+形成三元络合物沉淀。79Ⅱ．常用有机沉淀剂沉淀剂沉淀介质适用性与沉淀的离子草酸pH=1~2.5稀土金属离子

pH=4~5+EDTACa2+，Sr2+，Ba2+铜试剂(二乙基胺二硫代甲酸钠，简称DDTC)pH=5~6Ag+、Pb2+、Cu2+、Cd2+、Bi3+、Fe3+、Co2+

、Ni2+

、Zn2+、Sn（IV）、Sb（III）、Tl（III）pH=5~6+EDTAAg+、Pb2+、Cu2+、Cd2+、Bi3+、Sb（III）、Tl（III）铜铁试剂(N-亚硝基苯胲铵盐)3mol/LH2SO4Cu2+、Fe3+、Ti（IV）、Nb（IV）、Ta（IV）、Ce4+

、Sn（IV）、Zr（IV）、V(V)

80五、选择变性沉淀技术指利用蛋白质、核酸等生物大分子在某些理化条件的敏感性不同，有选择的使之变性沉淀，达到分离提纯的目的。这一方法主要用于破坏杂质，保存目标产物。81方法分类：（1）利用表面活性剂，或者有机溶剂引起变性。如核酸提取时加入氯仿、苯酚使蛋白质变性沉淀。（2）热变性沉淀分离。利用蛋白质的热稳定性差异进行分离。如黑曲霉发酵液40℃处理2.5小时，可去除90%淀粉酶，用于制备纯度较高的脂肪酶。（3）选择性酸碱变性。如大豆蛋白酶在pH

2.2以下或12以上发生变性，溶解度降低。（4）利用酶作用选择性变性。如凝乳酶催化牛乳酪蛋白沉淀。82六、非离子多聚物沉淀技术水溶性非离子多聚物沉淀剂：聚乙二醇（PEG），壬苯乙稀化氧（NPEO），葡聚糖，右旋糖酐硫酸钠。这一方法主要用于提纯蛋白、核酸和沉淀一些细菌及病毒。近年广泛用于酶的分离纯化。83可能机制：①聚合物与生物大分子争夺水分，导致大分子脱水沉淀。②聚合物对生物大分子的排斥作用使大分子聚集沉淀。③聚合物与生物大分子共沉淀。④聚合物与生物大分子以氢键形式形成复合物沉淀。非离子多聚物沉淀优点：⑴条件温和，不引起大分子变性；⑵分离效果好，成本低；⑶沉淀分离的选择性好；⑷多聚物容易去除，可回收。8485七、生成盐类复合物沉淀技术生物大分子和小分子都可以生成盐类复合物沉淀。（1）金属复合盐（2）有机盐（3）无机盐（1）金属复合盐Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+等可以与羧酸、胺及杂环等含氮化合物作用成盐沉淀（2）有机盐法苦味酸、苦酮酸、单宁、茶多酚等可以与蛋白质形成复合盐并沉淀。（3）无机盐法磷钨酸与磷钼酸与氨基酸作用形成盐类复合物沉淀。8687铜盐沉淀法制备谷胱甘肽100公斤面包酵母，加入硫酸、乙醇乙醚混合液10L，30℃抽提30min抽滤滤液用浓硫酸调节到0.5当量酸度40℃搅拌加入4g氧化亚铜，静置20min过滤硫酸洗涤沉淀；蒸馏水洗涤多次除去硫酸加水溶解谷胱甘肽铜盐通入硫化氢3h，还原通入氮气去除硫化氢抽滤加入丙酮，冷库静置2天丙酮洗2次，得谷胱甘肽8889八、其它沉淀技术氨基酸类物质的特殊沉淀剂：苯偶氮苯磺酸，2，4-二硝基苯酚-7-磺酸，二氨和硫氰化铬铵.大分子核酸类物质的沉淀剂：多价阳离子鱼精蛋白、硫酸链霉素.粘多糖类物质的沉淀剂：十六烷基三甲基季铵盐的溴化物（CTAB），十六烷基氯化吡啶（CPC）。90共沉淀分离所谓共沉淀是指在一种难溶化合物（载体）从溶液析出的同时，由于表面吸附等原因，溶液中某些可溶性杂质被沉淀下来而混杂于沉淀中的现象。利用共沉淀作用，可以对痕量组份主要是无机离子进行分离富集。这种富集方法具有快速、简便、富集倍数高等特点。因而广泛用于各种样品中痕量元素的分离、富集及分析。共沉淀剂可分为无机共沉淀剂和有机共沉淀剂两大类。9192（1）分类：无机共沉淀剂可分为：吸附共沉淀,混晶共沉淀用得较多的是具有吸附作用的氢氧化物、硫化物的沉淀。如Fe(OH)3、AI(OH)3、Mn(OH)2、PbS、CdS、SnS2、CuS等，都是常用的无机共沉淀剂。（2）特点：无机共沉淀剂，比表面积大，因而吸附富集效率高。选择性不高，但由于痕量组份经富集后可用原子光谱法分析，因而不影响测定效果。１、无机共沉淀剂93（3）常用无机共沉淀剂共沉淀方式载体共沉淀的离子或化合物吸附共沉淀氢氧化物Fe（OH）3或Al（OH）3Be2+、Ti（IV）、Zr（IV）、Sn（IV）、Cr3+、Co2+

、Ni2+

、Zn2+、Mn2+、ASO43-、PO43-硫化物CuSPb2+、Ni2+

、Cd2+、Ag+、Bi3+、Zn2+、Hg2+PbSCu2+、Ni2+

、Hg2+、Cd2+、Ag+、Bi3+、Zn2+氧化物MnO2Sb（III）、Sb（V）、Sn（IV）、Bi3+、Fe3+

单质Te或SeAu（III）、Pd（II）、Pt（IV）、Ag+、Hg2+混晶共沉淀BaSO4Ra2+

、Sr2+、Pb2+

SrCO3Cd2+

MgNH4PO4(MgNH4AsO4)AsO43-LaF3

Th（IV）942、有机共沉淀剂（1）分类：有机共沉淀剂可分为：离子缔合物

惰性共沉淀胶体的凝聚（2）特点：①富集效率高．可富集PPb级的痕量元素②选择性高。③有机载体可借灼烧而挥发除去，因而不存在基体元素对痕量元素测定的干扰问题。95共沉淀方式载体共沉淀的离子或化合物离子缔合物甲基紫（甲基橙、结晶紫、酚酞）的NH4SCN溶液Zn2+、Co2+

、Hg2+、Cd2+、Mo（VI）

惰性共沉淀8-羟基喹啉+酚酞的乙醇溶液Ag+、Co2+

、Cd2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+

胶体的凝聚动物胶辛可宁单宁硅胶钨酸铌酸、钽酸（3）常用有机共沉淀剂96甲基紫的NH4SCN溶液沉淀Zn2+（离子缔合物）97凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１mm大小块状凝聚体的过程。絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。凝聚和絮凝98凝聚：胶体粒子在中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）

机理：

1）中和粒子表面电荷

2）消除双电层结构3）破坏水化膜

（一）凝聚Coagulation99发酵液中菌体表面带有负电荷，由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。正离子同时受到使它们均匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表面的趋势。胶体双电层结构100两种相反作用力下，双电层分裂成两部：1）吸附层或stern层；2）扩散层。形成了扩散双电层的结构模型(Gouy-Chapman-Sternmodel)。胶体双电层结构101双电层与凝聚ζ电位与扩散层厚度δ和电动电荷密度q成正比，而扩散层厚度又与溶液中反离子强度和电荷成反比。对带负电性菌体的发酵液，高价阳离子的存在，可压缩扩散层的厚度，促使ζ电位迅速降低，而且化合价越高，这种影响越显著。102凝聚价或凝聚值在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，能脱除胶粒表面的水化膜，降低ζ电位，使双电层的排斥力减少，当不足以抗衡胶粒间的范德华引力时，由于热运动的结果导致胶粒的互相碰撞而聚集起来。电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（毫摩尔／升），称为凝聚价或凝聚值。103Schulze－Hardy法则：反离子的价数越高，凝聚价越小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力受化合价、水化半径、离子运动能力的影响，次序为Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+104常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝Al2(SO4)3•18H2O（明矾）；氯化铝AlCl3•6H2O;三氯化铁FeCl3;硫酸亚铁FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3絮凝分离技术胶体和悬浮物颗粒在絮凝剂作用下桥连成粗大絮凝体的过程称为絮凝作用。105絮凝沉淀法是在混悬的提取液或提取浓缩液中加入一种絮凝沉淀剂以吸附架桥和电中和方式与悬浮物发生分子间作用，使之沉降，除去溶液中的粗粒子，以达到精制和提高成品质量目的的一项新技术。絮凝剂的种类很多，有鞣酸、明胶、蛋清、101果汁澄清剂、ZTC澄清剂、壳聚糖等。106真溶剂分子：1×10-7cm胶体颗粒：1×10-4cm-1×10-7cm悬浮物颗粒：1×10-4cm-1×10-2cm溶解状态、稳定，可透过滤纸，扩散很快，可渗析、不沉淀。胶体状态、较稳定，能透过滤纸，扩散极慢，不能渗析、不易沉淀。不能透过滤纸、不扩散、不渗析、短时间内不沉淀。胶体和悬浮物的特点：①均为不溶物。②均具有布朗运动，碰撞使小颗粒聚集，进而絮凝。③均带有电荷，这也是胶体和悬浮物颗粒在液体中稳定存在的原因。107108絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括离子基团以及非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生架桥联结时，就形成较大絮团，产生絮凝作用。

絮凝109高分子絮凝剂的吸附架桥作用絮凝作用机理1、颗粒凝集2、双电层的压缩和电荷的中和作用3、桥连作用4、沉淀的网捕机理110胶体由于所带电荷的斥力大于颗粒布朗运动的动能，所以能够在液体中稳定存在。当平衡被打破，即出现脱稳状态。几种脱稳状态：（1）胶体颗粒水化膜具有粘滞力，颗粒间范德华力不足以把颗粒间夹层水化膜完全排斥，此时颗粒虽能够集结，但不能直接接触，称之为凝聚。（2）当颗粒的水化膜粘滞较弱时，颗粒间的范德华力足以把水夹层排挤出去，颗粒间直接接触，这样的过程成为凝结。（3）颗粒的凝聚和凝结都是胶体脱稳并形成细小凝聚体的过程，这些细小的凝聚体在絮凝剂的作用下生成体积较大的絮凝体，从水中分离出来，称之为絮凝过程。1、颗粒凝集111112双电层的压缩和电荷的中和作用电解质可以中和颗粒表面的电荷而压缩胶体中的双电层。胶体的电荷中和作用指由于胶体颗粒表面对带相反电荷的异电吸附而中和了胶粒的部分电荷，是胶体的ζ点位降低到足以克服斥力产生絮凝沉淀。双电层的压缩桥连作用是指溶液中胶体和悬浮颗粒通过有机或无机高分子絮凝剂吸附，形成桥架式空间结构的絮凝体的过程。网捕机理是利用金属盐或氧化物沉淀包被胶体或悬浮物形成沉淀。113絮凝值：使胶体溶液产生絮状沉淀所需的最小电解质浓度。絮凝剂的分类：絮凝剂无机絮凝剂有机絮凝剂无机低分子絮凝剂无机高分子絮凝剂天然有机高分子絮凝剂人工合成有机高分子絮凝剂无机阳离子絮凝剂无机阴离子絮凝剂铝盐无机高分子絮凝剂铁盐无机高分子絮凝剂人工合成阳离子有机高分子絮凝剂人工合成阴离子有机高分子絮凝剂人工合成非离子有机高分子絮凝剂114115可分为三类：人工合成有机高分子聚合物、天然有机高分子聚合物、无机高分子聚合物1）目前常用的是人工合成有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物；聚丙烯酸类和聚苯乙烯类衍生物。工业上使用的絮凝剂116

高分子聚合物絮凝剂根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：阴离子型（含有羧基)、阳离子型（含有胺基）、非离子型117聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点用量少，一般以mg/L计量；絮凝体粗大，分离效果好；絮凝速度快；种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂1182）天然有机高分子絮凝剂人工合成有机高分子絮凝剂虽然发展很快，但还存在着残留单体有毒，生物降解难等问题，所以其应用受到了限制。天然有机高分子絮凝剂具有无毒，易生物降解，原料来源广等优点。天然有机高分子改性絮凝剂根据其原料来源不同可分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。其中淀粉改性絮凝剂的研究开发最引人注目。1193）无机高分子聚合物有聚合铁系和铝系两大类铁系絮凝剂具有操作简单、费用低，受温度影响小，亲和力强，能有效地去除悬浮物、表面活性剂、破坏油水乳状液的能力很强等优点，缺点腐蚀性强、稳定性差。铝系是目前应用广、工艺较成熟的一类无机金属盐絮凝剂，絮凝效果好，缺点具毒性等。120微生物絮凝剂微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，一类由微生物或其分泌物产生的具有絮凝细胞功能的代谢产物。包括直接利用微生物细胞的絮凝剂、利用微生物细胞壁代谢产物的絮凝剂和克隆技术所获得的絮凝剂主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。121微生物絮凝剂1、微生物絮凝剂的商业化生产始于20世纪90年代，如红平红球菌及由此制成的NOC-1是目前发现的最佳微生物絮凝剂

2、微生物絮凝剂或将大部分替代普通絮凝剂3、浮游藻类、草分枝杆茵、硅酸盐芽孢杆菌。122絮凝的影响因素发酵液的性质（细胞浓度，表面电荷）；絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖；絮凝剂的分子量；pH控制；搅拌速度。影响絮凝效果的几个因素1、pH对絮凝作用的影响;2、温度对絮凝作用的影响，一般选择20-30℃;3、搅拌速度和时间，一般40-80r/min;4、高分子絮凝剂的性质和结构对絮凝作用的影响，线形﹥环形;5、有机高分子絮凝剂的相对分子量对絮凝作用的影响，一般在25000以上；6、絮凝剂的用量;123本章内容回顾1.机械破碎法2.物理破碎法3.化学破碎法4.酶学破碎法1.高压匀浆破碎2.珠磨破碎3.喷雾撞击破碎4.超声波破碎1.温度差破碎法（冻融破碎）2.压力差破碎法124沉淀precipitation

是利用沉淀剂使目标产物或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体凝聚物的过程。沉淀技术的特点沉淀属于粗分离操作。沉淀技术具有简单、经济和浓缩倍数高的优点。沉淀分离具有选择性;沉淀生物活性物质时需注意沉淀剂或沉淀条件是否会破坏活性；是否有毒；是否易除去。125沉淀技术的分类盐析法等电点法有机溶剂法选择变性法非离子多聚体法生成盐复合物法其它方法126盐析沉淀技术盐析salting-out