基因表达研究技术

基因表达研究技术刘亚鹏朱瑞生物工程141班基因表达研究技术刘亚鹏朱瑞

生物工程141班转录组测序二.RNA选择性剪接技术转录组：一个活细胞、组织或生物体内所有RNA的总和（包括mRNA、rRNA、tRNA及非编码RNA）转录组学：是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。简而言之，转录组学是从RNA水平研究基因表达的情况。一.什么是转录组及转录组学1.表达序列标签测序(EST)(1)原理

EST(ExpressedSequenceTag)是从一个随机选择的cDNA克隆进行5’端和3’端单向一次测序获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20到7000bp不等，平均长度为360±120bp。EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。二.研究转录组的方法（2）操作流程组织样品mRNA的提取→逆转录合成cDNA→构建cDNA文库→测序

通过对cDNA文库EST分析可以揭示用以构建cDNA文库的相应组织或细胞中mRNA的真正水平，因此可以通过大规模的EST分析研究表达图谱，以此得出特定组织类型在特定生理状态或是特定的发育阶段下基因表达情况。（3）表达序列标签测序在转录组中的运用（1）原理

基因表达系列分析（SAGE）是通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰富度不同的SAGE标签序列。在此方法中，通过限制性酶切可以产生非常短的cDNA标签，并通过PCR扩增和连接，随后对连接体进行测序。2.基因表达系列分析（SAGE）a.以biotinylatedoligo(dT）为引物反转录合成cDNA，以一种限制性内切酶（锚定酶）酶切.b.将cDNA等分为A和B两部分，分别连接接头A或接头B。每一种接头都含有标签酶酶切位点序列.（2）操作程序c.用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段，混合并连接两个cDNA池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物A和B扩增d.用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签片段并克隆、测序.e.对标签数据进行处理a.SAGE能够快速、全范围提取生物体基因表达信息，对已知基因进行量化分析。b.SAGE也能应用于寻找新基因。（3）.基因表达系列分析（SAGE）在转录组研究中的应用c.SAGE可用于定量比较不同状态下的组织细胞的特异基因表达。d.SAGE能够接近完整地获得基因组表达信息，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。（1）以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术。3.高通量测序技术

高通量测序技术的诞生可以说是基因组学研究领域一个具有里程碑意义的事件。该技术使得核酸测序的单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降,以人类基因组测序为例,上世纪末进行的人类基因组计划花费30亿美元解码了人类生命密码,而第二代测序使得人类基因组测序已进入万(美)元基因组时代。（1）原理

该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息.包括点阵列基因芯片和原位合成基因芯片。4.基因芯片技术a.芯片制备目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和点阵列的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。（2）操作流程b.样品制备生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中DNA或RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度。c.杂交反应

杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。d.信号检测和结果分析杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。

基因芯片以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。在基因表达检测的研究上人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥、酵母、人等的基因组表达情况进行了研究，并且用该技术一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异（3）基因芯片在转录组研究中的运用如：通过研究酵母从无氧环境到有氧环境时的表达谱，以及通过不同方式处理过的酵母菌的表达谱，发现约有5%的基因在表达量上有明显的变化。阿尔茨海默病中，出现神经原纤维缠结的大脑神经细胞基因表达谱就有别于正常神经元，当病理形态学尚未出现纤维缠结时，这种表达谱的差异即可以作为分子标志直接对该病进行诊断。

转录组的研究应用于临床的的另一个例子是可以将表面上看似相同的病症分为多个亚型，尤其是对原发性恶性肿瘤，通过转录组差异表达谱的建立，可以详细描绘出患者的生存期以及对药物的反应。选择性剪接的分类一般将选择性剪接分为：外显子选择内含子选择互斥外显子内部剪接位点大多数真核基因转录产生的mRNA前体是按一种方式剪接产生出一种成熟mRNA分子，因而只翻译成一种蛋白质。有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点)产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接。

可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制,是导致人类基因和蛋白质数量较大差异的重要原因。

RNA选择性剪接的意义可变剪接被认为是导致蛋白质功能多样性的重要原因之一，它使一个基因可编码多个不同转录产物和蛋白产物。已有实验研究表明，可变剪接在产生受体多