第四章DNA重组(含逆转录病毒简介)

遗传重组概述第一节同源重组第二节位点专一性重组第三节细菌中的转座成分概述：◘

只要有DNA，就会发生重组减数分裂高等Euk、体细胞核基因、叶绿体和线粒体温和噬菌体转座子转座◘生存→变异→突变，重组

适应环境、加速进化◘广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程◘

重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）

Ecoli中四种DNA重组的特征◘狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流◘遗传重组与重组DNA的区别类型需同源序列需RecA蛋白需序列特异性的酶同源重组

＋

＋

－位点专一

＋

－

＋转座

－

－

＋异常重组

－

－?第一节同源重组

homologousrecombination发生在同源DNA序列之间的重组Euk

减数分裂时的染色单体之间的交换细菌的转化，转导，接合后重组噬菌体重组发生前提是重组的两条DNA必须靠近，同源序列之间严格配对一、同源重组的特点：◘

涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大◘生成异源双链区◘存在重组热点（Chi）◘需要重组酶（RecA）◘DNA单链或单链末端是交换发生的重要信号双倍体染色体交换二、同源重组的机制1.单链侵入模型2.Holliday模型（双链侵入模型）3.双链断裂修复模型3‘5‘5‘3‘Meselson-Radding模型单链入侵模型（链转移模型）置换侵入Loop切除同化异构化分支迁移5’切割Holliday的异构化Holliday结构一经生成即可不断地处于异构化180o180o置换5‘5‘（1）（2）Holliday模型双链侵入模型2.侵入3.交互连接、异构化、分支迁移1.切割4.拆分核酸内切酶连接酶Holliday结构两种拆分方式“亲本链”“重组体”双链断裂修复模型分支迁移（branchmigaration）－－双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散，产生异源双链heteroduplexDNA异源双链的修复导致基因转变：一个基因转变为它的等位基因的遗传现象三、原核同源重组（E.coli）◘发生在双方DNA的同源区域

部分复制的染色体DNA之间或染色体DNA与外源DNA之间，细菌的转化、结合和转导

1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位点◘具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、序列特异性的单链内切酶活性◘单链内切酶活性和解旋酶活性，使DNA产生具有游离末端的单链－－－RecA的作用位点◘RecBCD有固定切割位点3‘a、RecBCD结合在DNA的平头末端（产生机制不清楚）b、外切、解链、移动（ATP）c、兔耳状loop结构产生（再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD

在loop单链区的

chi位点3’方4～6碱基处切断单链（单链内切酶）☀

chi位点：GCTGGTGG

目前发现的重组热点

E.coli

含1000个e、RecBCD

切割产生3’单链末端

2、RecA

蛋白

（1）

活性a、RecA

有单、双链DNA结合活性b、RecA

有NTPase

活性（底物差异活性）与单链DNA结合时活性最大---依赖于DNAc、RecA

有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子的能力，即联会同源DNA

（但其靶DNA必须有缺口－－结合DNA）

（2）RecA

蛋白催化双链和单链DNA

的反应阶段a、联会前阶段（缓慢）

RecA

与单链结合b、单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子

Holliday（5’侵入）c、从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链DNA，

反应结束时，RecA

结合到双链上RecA引起的链交换和Holliday结构的生成

RecA入侵单链被置换链RecA引发链侵入模型RecApromotestheassimilationofinvadingsinglestrandsintoduplexDNAsolongasoneofthereactingstrandshasafreeend.

RecA启动的单链入侵

3、原核同源重组的其它蛋白

需要E.coli

中三个基因RuvA，RuvB

和RuvC

的产物a、RuvA

识别Holliday结构的连接点b、RuvB

为分支迁移提供动力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC

核酸内切酶---专一性识别Holliday结构的连接点

◘E.coli

重组的各阶段（损伤修复）损伤DNA复制产生缺口RecA链交换第二次链交换DNApol

І通过DNA合成填满缺口RuvA，B分支迁移RuvC切割Holliday连接点第二节位点特异性重组

site-specificrecombination一、概念：发生在特异序列的DNA分子间的重组特点：在特定的结合序列部位有序列专一酶（整合酶）催化断裂重接

如：噬菌体整合到细菌基因组

二、λphage的整合与切除附着位点（attachmentsiteatt）溶源性细菌(lysogen)原噬菌体E.Coli

attB

含BOB’三序列23bpλphageattP

含POP’三序列240bp核心序列“O”完全一致，全长15bp（同源部分）BOB’+POP’BOP’+POB’

attB

attP

attL

attRIntIHFIntIHFXIS整合过程λ整合酶（integrase

Int）（λ编码）：单独存在只能催化BOB’和POP’之间的重组，不能催化BOP’和POB’之间的重组寄主的整合宿主因子IHF（integrationhostfactor）：寄主基因编码切除酶（Excisionase

Xis)：λ噬菌体的xis基因编码，与Int形成复合体

发生在O内的重组交换位点相距7bp◘Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，进而使holliday结构拆分◘重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交第三节细菌中的转座成分转座子(元)或转座元件(transposonortransposableelement):

基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）。转座（transposition）：转座元件的转移过程（不十分确切）1、发现和发展◘1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes

玉米果皮、糊粉层花斑突变

玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理

跳跃基因（jumpinggene）◘1947冷泉港实验室（美）BarbaraMcClintocka)不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性b)转座不是简单的转移，涉及转座子的复制Hotspots(热点)Regionalpreference(在3kb区域内的随机插入)d)某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排它性

（免疫性）e)靶序列在转座因子两侧会形成正向重复

f)转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应2、转座重组的特点c)转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）二、Prok.转座子种类简单转座子（simpletransposon）（插入序列insertionsequenceIS）复合转座子（compositetransposon）

◘共同特征：

a）两端有20～40bp的IR（invertrepeat

），为转座酶的识别位点

b）具有编码转座酶（transposase）的基因

c)插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（3～9bp）1、插入序列是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分◘命名：IS＋编号（鉴定类型）长度700～2000bp

靶位点的DR形成a)

Tn/TnAfamily转座酶基因、调节基因（解离酶）、抗抗生素基因

l

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpR

StrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrR

TmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)

2.5kb20kb

Tn3IRTnpA

Res

TnpR

AmpR

IR38bp38bp

转座酶

regulatorβ-内酰胺酶

2、复合转座子◘两种类型

b）两端重复序列为IS的复合转座子ISL

ISR臂中心区臂◘两侧的IS既可以是IR，又可以是DR（directrepeat

）状态（IR多）◘当两个IS组件相同时，其中任一个都可行使转座功能◘不同时，主要依靠一个DNA重组DNA重组三、转座子的转作机制及模式◘三种类型：复制型、非复制型和保守型1、复制型转座模式◘需两种酶：转座酶（作用于原拷贝两末端）解离酶（作用于复制后的拷贝）◘两大步

a)共合体形成切口－连接－复制

b)拆分2、非复制型转座模式◘供体上最终产生双链断裂◘供体位点如不能被修复则有致死效应3、保守型转座模式◘另一种非复制型◘与λ整合机制相似其转座酶与λ整合酶家族有关4、TnA转座模式◘复制型转座转座酶(tnpA)、解离酶(tnpR)◘解离酶需要特异的内部位点

双重功能：解离功能

tnpA及自身的阻遏物◘拆分位点–res

共合体拆分位点◘转座结果产生5bp

的正向重复序列

四、转座子转座频率的调控◘每个转座子控制自身转座的核心----控制转座酶的水平不到一个转座酶分子／世代／细胞1、Tn10转座机制◘Tn10为复合型转座子◘IS10R元件提供转座酶活性-----合成转座酶的序列◘自发转座频率---10-7◘Tn10转座酶水平是控制转座的关键◘有两种控制转座的方式

a）通过反义RNA的翻译水平控制◘IS10R外侧边缘两个启动子◘PIN控制I