流式细胞技术课件

第15章流式细胞技术的原理和应用陈鲤翔副教授Email：lxchen@流式细胞技术（Flowcytometry,FCM)

是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速对单个细胞或其他生物微粒（如细菌）的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。30年代：设想使细胞检测自动化50-60年代：分层鞘流原理、分光光度计定量细胞成分及结合测量值对细胞分类，提出细胞分选70年代：单克隆抗体技术和荧光标记技术1973年：第一台商用流式细胞仪FACSI发展方向：荧光染料的开发、细胞的制备方法、提高电子信号的处理能力等流式细胞仪的发展史BD公司流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSAriaMoFloAstriosEQ超高速流式分选系统Gallios流式细胞仪Beckman公司流式细胞仪Navios流式细胞分析系统测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理（如大小、内部结构）、化学特性（如DNA、RNA）的多参数测量，并具有明显的统计学意义；是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度技术、分子生物学技术、免疫学技术、流体力学、细胞化学、图像技术等众多领域的知识和成果；既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术的特点应用：细胞生物学，肿瘤学，血液学，免疫学，药理学，遗传学及临床检验学等细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性液流系统光学系统数据处理系统一、流式细胞技术原理1、流式细胞仪的基本结构：由样本和鞘液组成待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。

（1）液流系统FluorescenceSignalFocusedLaserBeamShealthFluid液流系统示意图InjectorTip样本管鞘液管激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）（2）光学系统光学系统示意图散射光的测定

细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。光信号的测定

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°~10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。

侧向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴细胞单核细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。线性放大器和对数放大器荧光测定荧光补偿FITCAPCPEPerCP/Cy5.5每一种荧光分子都发射某一特定波长范围内的光，然而这些荧光的发射光谱会发生重叠，有时这种重叠现象非常显著。荧光补偿是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。荧光补偿PEFITCPE+cellsFITC+cellsTodocolourcompensation:ForPureFITC+cells,=PEsignal-%FITCsignalForPurePE+cells,=FITCsignal-%PEsignalAftercompensationPEFITCPE+cellsFITC+cellsGOODcompensation:Y-meanoftheFITCcell=theY-meanof-/-cellsX-meanofthePEcell=theX-meanof-/-cellsPEFITCPE+cellsFITC+cellsOVERcompensation细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴弃去偏转落入收集器压电晶体产生机械振动不充电充电细胞分选分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。分选的技术要求（3）数据处理系统FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少参数单参数直方图双参数点图、二维等高图三参数直方图多参数分析数据显示方式由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。单参数直方图双参数点图双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。

用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。二维等高图三参数直方图

三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate)技术，来分析参数之间的相互关系。多参数分析Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。门（Gate）设置A淋巴细胞B单核细胞C中性粒细胞A、B、C均为任意门区阈（region,R）与门(gate,G)是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。Region设置D1CD4+/CD3-D2CD4+/CD3+D3CD4-/CD3-D4CD4-/CD3+如十字门分析时，就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。样本制备：单细胞悬液标记染色：光谱不重叠阴性对照的设置：检测标本的重复性质量控制二、流式细胞仪免疫分析的技术要求

外周血淋巴细胞样品的制备：淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。Ficoll，40kd，高密度，低渗透压，无毒性。（比重为1.0177±0.001的分层液)样本制备

利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图。培养细胞的样品制备：单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成单细胞悬液。新鲜实体组织单细胞悬液的制备机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。表面活性剂处理法：Triton-x100、皂素等。防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但细胞表面荧光染色分析不受影响。单细胞悬液的保存适用条件:有较高的量子产额和消光系数对488nm的激发光波长有较强的吸收发射光波长与激发光波长间有较大的波长差易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性常用的荧光染料与标记染色FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光细胞悬液异硫氰酸荧光素得州红能量传递复合染料藻胆蛋白类几种常见的荧光染料名称染料激发波长荧光颜色溶解性对PH敏感性特点异硫氰酸荧光素FITC488绿525易敏感易溶于水，与抗体结合不影响特异性得州红Texasred568红615不易不敏感稳定，偶联后量子产额低藻红蛋白PE488橙575易不敏感具较多发光基团，消光系数和量子产额高藻青蛋白PC488别藻青蛋白APC633红670能量传递复合染料PEcy5488红670易不敏感减少交叉，成本高常用的几类荧光染料 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。能量传递复合染料Laser488nmPECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷5藻红蛋白能量传递复合染料机制荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 组合标记：免疫荧光标记FITC+PE488525、575绿色、橙色FITC+Tred488525绿色

568615红色FITC+PeCy5488525、675绿色、红色FITC+ECD488525、625绿色、橙红色F+P+PeCy5488525、575、675绿、橙、红色F+ECD+PeCy5488525、575、675绿、橙红色、红色F+P+APC488525、575绿色、橙色

633670红色荧光染料激发波长（nm)发射波长（nm)颜色双或多参数荧光抗体的组合标记适当的制备方式处理红细胞实体组织来源标本用机械法温度25-37℃，PH7.0-7.2质量控制单细胞悬液制备的质控免疫荧光染色的质控温度PH染料浓度固定剂光路与流路校正:确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。PMT（光电倍增管）校准:保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准:保证计数的准确性。Flow-checkFlow-setFlow-count仪器操作的质控同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制：在流式检测中，样品标记、溶血、洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控，使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。免疫检测的质控三、流式细胞技术应用以细胞免疫功能测定为例淋巴细胞亚群活化的T淋巴细胞抗原特异性免疫细胞调控性T细胞树突状细胞先天免疫细胞淋巴细胞亚群T淋巴细胞(CD3+)名称功能CD3+CD4+辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD8+抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高

CD3+CD4-CD8-有调节功能的T细胞,其表达

/T细胞受体(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/静止的T淋巴细胞

当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低

CD45RA-CD45RO+记忆性T淋巴细胞

病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T细胞,感染时升高

感染时升高淋巴细胞亚群活化T淋巴细胞名称功能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味着HIV患者的预后较差B淋巴细胞(19+)CD19+CD23+活化的B细胞过敏患者中升高