专题1-第1节-DNA重组技术的基本工具

专题4

基因工程第1节基因工程的理论基础和技术2023/2/5

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。基因工程的别名：操作水平：原理：结果：基因重组重组基因通过基因工程使大肠杆菌生产人胰岛素。

一基因工程理论基础（1）DNA是主要的遗传物质；基因是DNA分子上具有遗传功能的DNA片段；染色体（染色质）是由DNA和蛋白质构成的（2）DNA有规则的双螺旋结构，进行半保留复制；

一基因工程理论基础1’2’3’4’5’脱氧核苷酸的结构2023/2/5磷酸二酯键DNA分子结构DNA分子进行半保留复制（3）中心法则的提出和遗传密码的破译。

一基因工程理论基础基因的表达包括遗传信息的转录和遗传信息的翻译基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA连接关键步骤三：抗虫基因导入受体(棉花)细胞解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：基因的剪刀——限制性内切酶基因的针线——DNA连接酶基因的运载工具——运载体二基因工程操作的技术DNA分子的切割技术DNA分子的运载工具DNA分子的连接技术别名来源种类作用作用结果阅读课本“限制性核酸内切酶——分子手术刀”的相关内容，填写下表自主学习一DNA分子切割技术主要从原核生物中分离纯化而来限制酶或限制性内切酶已经分离出大约4000种，如EcoRI、SmaI限制酶2023/2/5限制酶存在于原核生物中的作用是什么？

限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，而对自身DNA不起作用，从而达到保护自身的目的。2023/2/516仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是偶数个碱基还是奇数个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列2023/2/5别名来源种类作用作用结果阅读课本“限制性核酸内切酶——分子手术刀”的相关内容，填写下表自主学习一主要从原核生物中分离纯化而来已经分离出大约4000种，如EcoRI、SmaI限制酶1、识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列限制酶或限制性内切酶2023/2/5G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5’-磷酸二酯键3’端5’端3’端5’端限制酶的作用部位——磷酸二酯键2023/2/5中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G脱氧核苷酸和A脱氧核苷酸之间切开。EcoRI限制酶的作用2023/2/5

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。2023/2/5

SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C脱氧核苷酸和G脱氧核苷酸之间切开。中轴线SmaI限制酶的作用在G与C之间切割2023/2/5平末端平末端SmaI限制酶的切割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。2023/2/5别名来源种类作用作用结果阅读资料P2页“限制性核酸内切酶——分子手术刀”的相关内容，填写下表自主学习一主要从原核生物中分离纯化而来大约4000种，例如EcoRI、SmaI限制酶1.识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列2.使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。形成两种末端：黏性末端或平末端限制酶或限制性内切酶（专一性）2023/2/5CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG练习使用EcoRI剪切目的基因CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG

目的基因黏性末端2023/2/5★延伸：在一段DNA序列中获得某个特定性状的基因片段必须要用限制酶切几次？共产生几个黏性末端或平末端？酶切两次共产生四个黏性末端或平末端运载体作用运载体的必要条件运载体种类阅读课本“分子运输车——运载体”的相关内容，填写下表自主学习二1）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。2）能够在受体细胞中复制并稳定地保存。3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。4）必须是安全的，对受体细胞无害。5）载体DNA应大小适中，以便于提取和操作1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制①细菌的质粒②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。2023/2/5拟核有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。能复制并带着插入的目的基因一起复制质粒：是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。最常用运载体——质粒有切割位点2023/2/5把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键DNA连接酶的作用2023/2/529类型来源功能相同点差别E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体催化形成磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)分子缝合针——DNA连接酶的类型2023/2/5两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来DNA连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！2023/2/5DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低DNA连接酶的缝合作用2023/2/5AATTAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用2023/2/5DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA连接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键例：限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。（1）请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？

可以连接。因为由上述两种不同限制酶切割后形成相同的黏性末端（或是可以互补的）小试身手可连接：具有互补的黏性末端的DNA末端；同一种限制性内切酶切割得到的DNA末端2023/2/5限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：（1）...CTGCA(2)...AC(3)...GC(4)...G

...G...TG...CG...CTTAA

(5)G...(6)...GC(7)GT...(8)AATTC...ACGTC......CGCA...G...你能用DNA连接酶将它们连接起来吗？_____和_____能连接形成__________________和_____能连接形成__________________和_____能连接形成__________________和_____能连接形成_____________15...CTGCAG......GACGTC...27...ACGT......TGCA...36...GCGC......CGCG...48...GAATTC......CTTAAG...转基因抗虫棉培育流程核心步骤植物：农杆菌转化法实验分析：小结基因工程的工具限制酶来源：主要存在于原核生物中特点：具有专一性(识别序列)功能：识别；切开DNA分子的磷酸二酯键结果：形成黏性末端或平末端DNA连接酶功能：连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶载体具备的条件结构简单,大小适中能在受体细胞中自我复制并稳定存在具一个至多个限制酶切位点具标记基因安全无害种类：质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒1.判断质粒是基因工程中唯一的运载体运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成氢键练习×√×1）以下说法正确的是（）

A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列

B、质粒是基因工程中唯一的运载体

C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接

D、基因控制的性状都能在后代表现出来C练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是

A、能复制（）

B、