丁二胺与戊二胺的介绍

关于两种二元胺微生物发酵法生产的介绍李小刚目录1,5—戊二胺谈第二章1,4—丁二胺谈第三章胺谈第一章第一章胺什么是胺？氨分子中的氢原子被烃基取代后的产物。R=烷基：脂肪胺芳基：芳香胺伯胺(一级胺)仲胺(二级胺)叔胺(三级胺)季胺(四级胺)4第二章戊二胺2.11,5—戊二胺的性质1,5—戊二胺又称为尸胺，是一种多胺,又名1,5一二氨基戊烷,是一种粘稠状液体,沸点178一180度,折光率为1.463，易溶于水、乙醇、难溶于乙醚,深度冷冻可凝固结晶,但在常温下又熔为液体，有六氢吡啶的臭味,在空气中发烟,能形成二水化合物。它是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱,它在腐烂的尸体中可以分离得到。52.21,5—戊二胺的应用在农业、医学、工业等领域有着广泛的应用1在农业上，1，5－戊二胺作为第三信使可用于调节植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育2在医学上，可作为一种有效治疗痢疾的药物，也是微生物细胞内调节铁离子浓度的“铁亲和系统”的主要组成成分；3在工业上，作为一种重要的工业化工原料，是由可再生原料衍生得到的生物聚酰胺，广泛应用于各种聚酰胺产品；可以替代传统的由化工方法生产的生物胺———己二胺，与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料———新型尼龙5662.31,5—戊二胺的生产微生物转化法

谈微生物直接发酵法直接提取法谈7尸胺是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱,它在腐烂的尸体中可以分离得到，但是由于含量较低,不适合大量生产直接提取法8产量72g/L2009年德国学者学者Martin·费尔科特,B·恩斯特等人以C.glutamicum为出发菌株，经发酵、pH调控、热处理、萃取、蒸馏纯化等过程，经80h发酵后，最终获得戊二胺产量可达72g/L。2005年日本东丽尖端融合研究所通过对赖氨酸工业生产上所用的谷氨酸棒杆菌进行转基因操作,把来源于大肠杆菌的赖氨酸脱梭酶基因的表达单元插入高丝氨酸脱氢酶基因座，发酵15小时生产出2.5g/L产量2.5g/L2010年天津科技大学牛涛等通过PCR扩增获得蜂房哈夫尼菌

中的赖氨酸脱羧酶基因ldc，以大肠/谷氨酸棒杆菌

穿梭质粒pXMJ19为载体，将目的基因ldc克隆至谷氨酸棒杆菌中，经36h发酵，产量为0.96g/L产量0.96g/L微生物直接发酵法9产率38%日本学者Takahshi研究大肠杆菌

的游离细胞，以D，L－赖氨酸为底物通过LDC不对称降解L－赖氨酸获得D－赖氨酸和1，5－戊二胺，经过多步骤的产物分离过程，可达到38%的产率。产物分离过程复杂,成本高，细胞无重复使用性。

蒋丽丽等研究了4种固定化蜂房哈夫尼菌菌体细胞的材料和方法,包括海藻酸钙包埋法，半透膜透析袋法,海藻酸钙一明胶交联包埋法和明胶包埋法，其中海藻酸钙包埋法稳定性最好。用该方法转化测得酶活可达1028.9U/mL，重复性佳:第一批固定化细胞酶活可达游离菌体的98.62%,第四批为第一批的38.68%海藻酸钙包埋法朱婧在《微生物转发L-赖氨酸为尸胺》的硕士论文中优化了产酶培养基和培养条件，经过20h的反应,细胞的酶活基本比较稳定,20h时还能保持起始酶活的91%,投入底物赖氨酸160g,应得尸胺111.1g,实际得到尸胺105.11g,尸胺收率为94.61%。收率94.61微生物转化法10采用游离细胞进行微生物转化法生产戊二胺，虽然能够富集赖氨酸脱羧酶，无重复使用性较差，并且由于菌种不能积累赖氨酸，需要外加赖氨酸作为酶的反应底物，故仍无法解决原料成本过高的问题。112.4戊二胺的代谢机理研究L—赖氨酸脱羧反应机理12L一赖氨酸脱羧酶(L一lysinedecarboxylase,简称LDC),是可逆的将赖氨酸脱C02生成尸胺(1,5一戊二胺)的酶，此酶是诱导性胞内酶,需磷酸毗哆醛为辅酶促进脱羧反应。LDC存在于E.coli、尸杆菌(Bacteriumcadaveris)、Hafniaalvei等大多数微生物中，其也存在于高等植物中，如黄瓜等。其中细菌来源的赖氨酸脱羧酶有2种:cadA和

ldcC，ldcC是功能基因，在任何时候表达量都很弱。此外，在携带ldcC多拷贝量的菌株中，赖氨酸脱羧酶酶活会增加。赖氨酸脱羧酶（LDC）131,5—戊二胺在E.coil中的代谢图谱14目前，在工程菌的研究改造方面多集中于C.glutamicum,

C.glutamicum

的最佳生长pH条件为中性，而ldc在中性条件下更有利于提高其表达量；因此，一方面有构建携带ldc基因或赖氨酸—戊二胺反向转运调节基因cadB的穿梭质粒，在C.glutamicum中复制表达蛋白;另一方面或将ldc基因插入到C.glutamicum的基因组中进行表达。15高浓度的尸胺不仅具有反馈抑制作用，还可导致细胞膜孔蛋白的关闭，影响细菌的正常生长，戊二胺代谢系统不仅包括其生物合成系统，还包括其转运系统、降解等代谢系统，我们需要深入研究微生物中1，5－戊二胺代谢途径、关键酶、代谢流动分配和控制因素等。改造思路：①主要通过过量表达赖氨酸脱羧酶基因，通过构建携有ldc基因的多拷贝质粒；②用强启动子增强赖氨酸脱羧酶基因的转录水平；增加赖氨酸代谢支路的流量；③增加1,5—戊二胺的排泄或筛选解除产物反馈抑制突变株以解除1,5—戊二胺对赖氨酸脱羧酶的反馈抑制；④敲除压力反馈调节基因rpoS，降低戊二胺对菌体生长代谢的抑制作用。16技术手段：

①进行有效基因定向改造，利用易错PCR、DNA改组、杂合酶、交错延伸等酶的体外定向进化的方法对赖氨酸脱羧酶进行基因改造；②应用生物信息学和代谢组学等知识构建完善的代谢模型和计算模型，对产物代谢流进行分析；③采取单因素、响应面法和正交设计法等方法，优化产酶培养基条件，从而达到提高酶活、进一步提高1，5－戊二胺产量的目的；④采用恒温等离子诱变技术（ARTP）对现有高产赖氨酸工程菌进行等离子诱变，筛选正突变菌株。172.5简述德国巴斯夫公司有关戊二胺的提取工艺技术1，去除发酵液中的细胞；2，碱化发酵液——通过加入碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物将发酵液调整到PH=11，或者更高，依据乙酰基DAP的量；3，热处理发酵液——将碱化的发酵液通过加热到回流温度进行热处理；4，采用偶极质子性有机溶剂琏烷醇或环烷醇作为萃取剂（在升高的温度下进行）；5，通过蒸馏提纯或在相中沉淀从取出的有机相中分离DAP18易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高Mg离子浓度，加入锰离子，改变体系中四种dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。其关键在于对合适突变频率的选择，突变频率太高会导致绝大多数突变为有害突变，无法筛选到有益的突变，频率太低则会导致文库中全是野生型群体。理想的碱基置换频率和易错的最佳条件主要依赖于突变的DNA片段的长度。连续易错PC策略（sequentialermr-PronePCR）：将一次扩增得到的有益突变基因作为下一次扩增的模板，连续反复的随机诱变，让有益的正突变不断的积累。DNAshuffling：目前最方便，有效的一种分子水平的体外定向进化技术，通过对单基因或相关基因家族的靶序列进行多轮随机诱变、重组和高通量筛选，可以有效富集正突变，去除负突变，提高突变文库的丰度。2.6词条：易错PCR及DNA重组19第三章丁二胺分子式：C4H12N2，分子量为88.15，白色结晶，熔点27—28℃，沸点为158—159℃，相对密度为0.8777，易溶于水，能吸收二氧化碳，有强烈的氨臭味。用途：有机合成中间体，用于制药和生化研究；制备表面活性剂，以及农用化学品；是合成新型材料尼龙46的原料。制备方法：由吡咯和盐酸羟胺反应得丁二肟(wo),经还原得丁二胺；也有通过丁二氰脱氢反应来制备丁二胺。3.11,4—丁二胺的性质203.2大肠杆菌中1,4—丁二胺的代谢图21E.colipossessestwoformsofODC:oneisaconstitutiveoneencodedbythespeCgene,andtheotherisaninducible(可诱导)oneatlowpH,whichisencodedbythespeFgene.Inanearlierstudy,recombinantE.coliDR112strainoverexpressingthespeCgeneproduced25mg/Lofputrescine(KashiwagiandIgarashi,1988).Morerecently,Eppelmannetal.(2006)reportedproductionofputrescineupto5.1g/Lbyfedbatchculture（补料分批培养）ofE.coliLJ110overexpressingthespeFgene.Eventhoughthisconcentrationisrelativelyhigh,itisnothighenoughtobeconsideredtobecompetitivewiththeexistingchemicalprocess.Also,theuseofratherexpensiveisopropyl-b-D-thiogalactopyranoside(IPTG)asaninducerintheabovestudyisnotencouragedforrealindustrialapplication.223.3改造思路3.4改造方法①构建含有speC基因的低拷贝p15speC质粒；②敲除染色体基因；③用trc启动子替换原基因启动子23其中实心正方形曲线图为XQ52菌株并携带p15speC。空心曲线为XQ43菌株并携带p15speC质粒。atoC基因跟短链脂肪酸的代谢有关；rpoS压力调控基因,是大肠杆茵RNA聚合酶的一个亚基。在压力情况下，如高温、酸、渗透冲击、营养缺陷和生长进入稳定期等能够被诱导，并在一定程度上能够取代σ70与核心酶结合形成全酶，从而激活多数σs依赖的基因的转录243.5学习与总结质粒构建易错PCR酶工程

学习什么？启动子替换rpoS代谢流25[1]蒋丽丽,刘均忠,沈俞,等.用固定化L一赖氨酸脱梭酶细胞制备1,5一戊二胺[s].精细化工,2007,11:1079一1084.[2]牛涛，黎明，张建中等.一步法生产1,5—戊二胺谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建[J].中国生物工程杂志，2010,93-99.[3]朱婧.微生物转化L－赖氨酸为尸胺的研究[D].天津:天津科技大学.2009．[4]黄云雁黎明刘萌，等.赖氨酸-尸胺反向转运蛋白cadB基因谷氨酸棒杆菌表达载体的构建及转化[J].生物技术通报,2012,8[5]M·弗尔科特，O·策尔德尔，B·恩斯特，等.发酵生产1,5—二氨基戊烷的方法[P].200980110562.9,2009,1,23.[6]刘玉芳.尼龙54的改性[