硕士研究生(眼科学)开题报告

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自噬相关蛋白p62及LC3在大鼠急性高眼压模型视网膜中的表达及意义研究生：郑冰茹导师：吴瑜瑜教授立项依据目录研究目的、意义主要内容及创新点123458预期结果及可能的问题实验进展安排6预实验结果立项依据

青光眼是一组以视网膜神经节细胞（retinalganglioncells，RGCs)及其轴突数目进行性丢失、视盘凹陷扩大、视野缺失为特征，伴眼压升高的致盲性眼病。立项依据青光眼视神经病变的发病机制立项依据青光眼视神经病变的发病机制氧化应激反应神经营养因子剥夺谷氨酸兴奋毒性反应胶质细胞的激活免疫调控紊乱视神经轴突的保护视盘重塑RGCs的保护立项依据免疫调控自噬在青光眼视神经病变发病机制中的作用自噬Autophagy立项依据

自噬（Autophagy）即真核生物通过溶酶体机制降解细胞内组分的过程。细胞通过自噬降解胞内细胞器、微生物、可溶性蛋白及RNA以维持胞内稳态，并提供营养物质及代谢原料。立项依据自噬的过程立项依据自噬体标记蛋白LC3

定义：微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associatedprotein1lightchain3，LC3/Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白。

分类：①LC3-I蛋白：散在分布在胞浆内

②LC3-II蛋白：定位于自噬体的内膜和外膜

检测意义：①LC3-II的水平在某种程度上反映了自噬体的数量

②自噬时表现为LC3-I的减少和LC3-II的增加，通过LC3-II/LC3-I或者LC3-II/(LC3-I+LC3-II)即可反映自噬水平立项依据自噬过程的调控[1]MónikaL,PéterL,Theroleoftheselectiveadaptorp62andUbiquitin-LikeproteinsinAutophagy立项依据自噬相关蛋白p62

功能：在自噬降解泛素化蛋白、错误折叠及异常积累的蛋白和功能失调的细胞器的过程中起调控作用作用机制：通过LC3相互作用区（LC3interactingregion，LIR）与自噬体膜的Atg8/LC3结合，从而介导自噬途径对异常积累蛋白及细胞器的识别及降解。

检测意义：①自噬流发生时p62水平下降②自噬体形成过多，或自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶

体的过程发生障碍时则p62水平增高立项依据p62在凋亡、细胞存活中的作用立项依据KjtaokaY[3]等人研究发现眼压稳定升高时，视神经中p62及LC3-II水平增高，提示自噬流的聚集参与其中；另外，该研究发现烟酰胺单核苷酸磷酸转移酶3(nicotinamidemononucleotideadenvlYltransferase，NMNAT)表达升高，Nmnat能维持轴突蛋白的稳定性和调制轴突内囊泡运输，对轴突发挥保护作用。抑制细胞内p62水平，促进LC3-II表达，诱导自噬并保护轴突。

PaulS[4]等人发现自噬调节蛋白p62可降解BCLl0，调控NFKBl一RELA通路，抑制T细胞分化。[3]KjtaokaY,MunemasaY,KojimaK,eta1．AxonalprotectionbyNmnat3overexpressionwithinvolvementofautophagyinopticnervedegeneration[J]CellDeathDis，2013，4：e860.[4]PaulS，SchaeferBC．SelectiveautophagyregulatesTcellactivation[J].

Autophagy，2012，8(11)：1690—1692．p62在青光眼视神经病变中的作用立项依据p62在青光眼视神经病变中的作用p62免疫调控清除作用凋亡途径轴突保护研究目的及意义研究目的检测大鼠急性高眼压模型中RGCs凋亡率并观察其形态变化

检测p62、LC3蛋白在大鼠急性高眼压模型视网膜中的表达情况

探讨p62在大鼠急性高眼压模型视网膜中的作用及机制探讨自噬过程与大鼠急性高眼压模型视网膜神经节细胞存活的联系研究目的及意义研究意义利用自噬清除细胞内受损细胞器、降解大分子蛋白质及维持细胞稳态的功能，提高视网膜神经节细胞的耐受力

通过研究自噬调节过程，探讨其可能作用机制，为青光眼视神经保护提供新的思路研究主要内容构建大鼠急性高眼压模型（0.9%的生理盐水灌注法）按时间段分组，获取视网膜组织及蛋白，进行关于p62、LC3的Western蛋白印迹检测，免疫组化，定性定量分析表达水平检测视网膜神经节细胞的凋亡情况检测p62、LC3在视网膜各层的表达情况检测p62、LC3蛋白的表达量获取数据，进行统计学分析（拟用spss17.0进行分析，选取检验水准α=0.05）研究主要内容大鼠110cm(约88mmHg)25G（0.55*20mm）的输液针头0.9%生理盐水以瓶内的液体不再向眼内滴注、虹膜苍白和视网膜苍白水肿等作为动物眼达到外界给定压强的判断依据，维持高眼压状态60min优点：操作简单，研究时程短，结果具有较好的可重复性。点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本成年雌性SD大鼠55只正常对照组急性高眼压组建模24h48h12h1h0h免疫组化Western-blot细胞免疫荧光HE染色TUNEL法p62、LC3蛋白在视网膜的定性及定位情况计算RGCs的数量；检测RGCs的凋亡率p62、LC3蛋白在视网膜的定量检测

技术路线图主要创新点

思路创新：以往关于青光眼视神经病变的研究主要集中在视网膜神经节细胞凋亡的信号通路，而本实验从新的角度——自噬探讨其在大鼠急性高眼压模型视网膜神经节细胞的作用实验设计：自噬是一个随时间不断变化的动态过程。因此，实验设计根据五个不同时间点对实验动物进行分组；并分别从形态学，蛋白质水平出发，更全面分析自噬过程与视网膜神经节细胞之间的关联预期结果

HE染色：正常对照组可见视网膜各层分布整齐结构清晰，高眼压组初期视网膜呈水肿状态，随着时间延长，各层呈萎缩状态；TUNEL法：高眼压组凋亡率随时间延长而增加；免疫组化：高眼压组p62、LC3蛋白在视网膜多层中均有表达；Westernblot：高眼压组p62蛋白的表达随着时间先减少，随后增加；LC3蛋白的表达随时间延长先增加，随后减少问题及解决方案实验过程问题解决方案造模过程麻醉不足，动物提前苏醒；麻醉过深，动物致死严格按量麻醉，正确腹腔注射，缩短操作时间取材过程眼球标本的保存提前准备液氮用以冰冻保存，4%多聚甲醛固定检测过程检测机器误差人为造成误差尽可能在同一台仪器测量，并多次重复测量预实验结果正常0h1h48h12h24hLC3-ILC3-IIΒ-actin实验进展安排201