质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

一、实验流程简述实验内容流程，PCR操作步骤↓煮菌，PCR（PCR程序最后设4℃保温）↓约2小时收集PCR产物学习PCR原理质粒DNA提取（约1小时）↓紫外检测定量知识（计算方法），步骤↓紫外检测定量↓酶切步骤↓酶切约1~2小时↓学习酶切原理，琼脂糖电泳原理↓电泳（样品：质粒DNA，PCR产物，酶切产物，Marker）↓约30分钟观察电泳结果、记录、拍照、保存灭菌去离子水19l2*Premix25l正向引物-SO100(10M)2l反向引物-SO101(10M)2l菌液：2l总体积50l取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头,且PCR反应管标记在侧面)：

如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心或者将反应管盖上盖子使劲甩，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上。

仪器:PCR仪(BioRadMJmini)台式离心机灭菌的薄壁离心管凝胶电泳系统等凝胶成像系统

一、实验仪器2、离心层析柱硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质；通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；四、实验步骤取1.5ml培养物加入Eppendorf管中9000rpm×30s，弃上清加入250μl溶液P1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。加入250μl溶液S2，颠倒6～10次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮.加入400μl溶液S3，立即温和混匀，室温放置3-5min。13000rpm离心10min，小心取上清液（700-800μl

）。将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液。加入500μl去蛋白液W1，13000rpm离心1min，弃滤液，向吸附柱中加入500μl漂洗液W2，13000rpm离心1min，弃滤液。重复步骤8一次。空柱13000rpm离心2min，然后室温放置3-5min，使残留乙醇挥发。取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加60μl-100μl洗脱缓冲液Eluent，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA，-20℃保存备用。在一个洁净的1.5ml离心管中混匀下列反应物：混合后37℃水浴1-2h。用酶切产物进行电泳注意事项：不要有气泡，并尽量使液体在离心管底部。质粒DNA的酶切分析反应物体积（µl)无菌去离子水10.010×M酶切缓冲液2.0EcoRI1.0HindIII1.0质粒DNA6.0总计20ul二、实验目的掌握碱裂解法提取质粒的方法了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理和测定方法了解质粒酶切鉴定原理学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小掌握PCR基因扩增的原理和操作方法聚合酶链式反应(PCR)PolymeraseChainReaction仪器:PCR仪(BioRadMJmini)台式离心机灭菌的薄壁离心管凝胶电泳系统等凝胶成像系统

一、实验仪器1、

菌液：DNA模板(含靶基因片段)2、引物：正向引物：5’GTA

AAA

CGA

CGG

CCA

GT3’

反向引物:5’CAG

GAA

ACA

GCT

ATG

AC3’3、2×Premix

：

Taq酶：5U/μl4×dNTP:10mMeach10×buffer:500mMKCl,100mMTris-HCl(pH8.3)MgCl2:25mM4、灭菌去离子水二、试剂

①94℃预变性2分钟后开始以下循环②94℃30秒

55℃30秒30循环

72℃60秒③72℃8分钟；④4℃保温。实验过程约1小时30分钟三、实验步骤温度（℃）时间（min）94725094℃变性（30s）50℃退火（30s）72℃延伸（60s）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。DNA变性形成2条单链DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍灭菌去离子水19l2*Premix25l正向引物-SO100(10M)2l反向引物-SO101(10M)2l菌液：2l总体积50l取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头,且PCR反应管标记在侧面)：

如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心或者将反应管盖上盖子使劲甩，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上。

四、结果分析1、用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定;2、加5uLPCR产物进行电泳;3、预期PCR产物大小约400~500bp;*由1985年穆里斯（K.Mullis）发明，他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。五、实验原理变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链实验原理

5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55原理示意图

Cycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。PCR反应系统的组成

模板DNA

引物

dNTP

耐热的DNA聚合酶缓冲液(一)模板DNAPCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。模板的浓度要适当

基因组DNA：50-100ng质粒DNA:5-10ng(二)引物与摸板DNA链互补的小片段DNA分子；PCR特异性反应的关键；引物1引物2引物的特异性：引物的设计与合成对PCR的成功与否起着决定性的作用引物的浓度：引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成一般认为PCR反应中引物的终浓度为0.2～1μmol/L为宜引物的设计：使用引物设计软件NTI9.0,PRIME5.0等引物的设计原则：1、引物长度：15~25个核苷酸，最佳长度为18～21个核苷酸。2、(G+C）%含量:40%~60%。并且，两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。3、两个引物之间配对碱基数小于5个。4、引物自身配对的碱基对数不大于3。特别是在引物3’端。5、引物与模板非特异性配对为点的碱基配对率小于70%。6、Tm值高于55℃（三）Taq

酶从水生栖热菌Thermus

Aquaticus

（Taq

）中分离出的热稳定性DNA聚合酶酶浓度：酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增每100μl反应液中含1-2.5UTaqDNA聚合酶为佳保存：-20℃（四）dNTP

dNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（五）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。①变性温度与时间变性充分：变性温度越高，时间越长变性就越充分。变性温度、时间要适应：温度过高、时间过长又会影响TaqDNA聚合酶的活性，变性温度90-95℃为宜。②退火温度与时间：复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好，升高复性温度可以增加非特异性结合，大多数PCR反应的复性温度在35－70℃,一般低于引物Tm值的5℃左右。复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。引物延伸温度一般为72℃。延伸时间：72℃时，核苷酸的合成速度为35-100个核苷酸/S，这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。然而，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。③延伸温度与时间：PCR循环次数循环次数要恰当：一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。常规PCR循环次数一般为25～40个周期。PCR相关技术荧光定量PCR（real-timePCR）PCR相关技术融汇PCR技术、DNA探针杂交技术（标记有荧光报告基团与荧光淬灭基团），结合先进的光谱检测技术发展起来的一项新技术，通过测定荧光强度来对PCR产物进行实时定量。PCR相关技术优点：起始定量PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆（二）基因突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA的序列测定（五）基因的突变分析PCR的临床应用遗传病的诊断：β-地中海贫血诊断、产前诊断、肝癌研究、α-1抗胰蛋白酶缺陷症、苯丙酮尿症、痛风病等诊断研究生物识别：PCR已用于人免疫缺陷病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（HPV）等十几种病毒检测癌基因的研究：选择肿瘤基因突变部位进行扩增，可协助对肿瘤的诊断。质粒DNA的提取与定量

ExtractionandQuantitationofPlasmidDNA一、什么是质粒？独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；基因工程常采用的载体方法：

碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法

概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离、纯化质粒DNA二、实验原理

基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。

当以pH4.8的NaAc溶液调节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三、实验材料宿主菌：大肠杆菌DH5a菌株载体：PMD-19T质粒插入片段基因：CHD5目的片段400bp质粒大小为:2692bp+400bp=3092bp酶切片段大小为?米尔副教授领导的研究小组发现的CHD5，其编码基因位于1号染色体的特异部分（1p36）。当CHD5失去功能的时候，细胞内平时起抑癌作用的系统会被关掉。CHD5如同肿瘤抑制网络的总开关，这提示CHD5与多种人类癌症有关。根据CHD5的调节功能，可以设计更好更有效的癌症治疗策略。此前，这个基因一直是个谜。这项研究对未来的癌症治疗将产生重要影响，提高CHD5的表达量会带来额外的抑癌效果。临床实验中也发现，许多神经胶质瘤患者的CHD5基因缺失，说明CHD5与人类癌症有莫大关系，打开CHD5开关功能的药物可能会对很多种癌症的治疗有效。补充知识：模板基因溶液P1（细菌悬浮液）已加入RNaseA溶液P2（细菌裂解液）溶液P3（中和液）去蛋白液PE洗脱液WB

已加入无水乙醇灭菌水（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5α（三）试剂：

LB培养基（液体、固体）Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）溶液I

50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)2

mg/mL溶菌酶作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液II0.2mol/LNaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)1%SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III5mol/L乙酸钠 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液中钠的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA沉淀，Na＋可中和DNA2、离心层析柱硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质；通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；四、实验步骤取1.5ml培养物加入Eppendorf管中9000rpm×30s，弃上清加入250μl溶液P1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。加入250μl溶液S2，颠倒6～10次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮.加入400μl溶液S3，立即温和混匀，室温放置3-5min。13000rpm离心10min，小心取上清液（700-800μl

）。将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液。加入500μl去蛋白液W1，13000rpm离心1min，弃滤液，向吸附柱中加入500μl漂洗液W2，13000rpm离心1min，弃滤液。重复步骤8一次。空柱13000rpm离心2min，然后室温放置3-5min，使残留乙醇挥发。取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加60μl-100μl洗脱缓冲液Eluent，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA，-20℃保存备用。菌液离心12000rpm,1min弃上清短时离心彻底弃上清加250μl溶液P1旋涡振荡悬浮沉淀加250μl溶液P2加400μl

溶液P3颠倒颠倒数次放置3-5min离心13000rpm,10min取上清700μl加到吸附柱中离心13000rpm,1min弃滤液，加入500μl去蛋白液13000rpm,1min离心（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）弃滤液，加入500μl漂洗液WB（10）离心13000rpm,1min弃滤液，加入500μl漂洗液WB（11）离心13000rpm,1min弃滤液（12）离心13000rpm,2min放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加70μl洗脱液EB离心13000rpm,1min（13）-20℃保存备用四．质粒定量检测

紫外分光光度计法

原理：1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应

2,而且物质对光的吸收是具有选择性的

3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱一、质粒定量紫外吸收检测质粒DNA的浓度和纯度核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。260nm时，1A=50g/mL

dsDNA=37g/mL

ssDNA

=40g/mL

RNA

=30g/mL

Oligo可以通过计算确定双链DNA浓度，公式如下:

dsDNA=50×(A260)×稀释倍数以上浓度单位为g/mL（注：本实验要用的eppendorf公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度和Ratio值.）A260/A280可以反应DNA的纯度：可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（A260/A280）估计核酸的纯度。A260/A280=1.8，纯净DNAA260/A280<1.8，说明样品中含有蛋白质或酚等污染。应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。A260/A280>1.8，说明有RNA污染，可用RNA酶处理

二、实验仪器三、实验方法1．打开仪器电源开关，无需预热。2．根据样品的不同，在仪器控制面版上选择对应的方法组，如测量质粒DNA浓度选，测量RNA浓度选等，以此类推。3．选择进入方法组后，选择你所需要的方法，然后按enter键确认。4．按parameter/dilution键设置样品稀释倍数，输入样品的体积和稀释样品所用稀释液的体积，按enter键确认。（取质粒DNA样品2μl+98μl灭菌水）5．后推打开仪器上放置石英比色皿的槽盖。6．按照设置的稀释方法，先向石英比色皿中加入对应体积的空白稀释液，然后把石英比色皿放入检测槽，按blank键进行调零。7．再按照设置的稀释方法，向石英比色皿中加入对应体积的样品，并用微量加样器轻轻混匀。8．按sample键，仪器会根据样品的稀释倍数自动计算出样品的最终浓度。注意事项：1．为确保液体始终处于检测区的中心位置，被检测样品的体积必须≧50ul。2．为避免石英比色皿受到污染，每次检测样品浓度前后都要用灭菌蒸馏水或去RNase水清洗石英比色皿3．实验结束后，前推盖上检测槽的槽盖，并关掉仪器电源。数据处理测量次数质粒DNA浓度(μg/ml)Ratio值(A260/A280)123平均值酶切鉴定

DNArestrictionenzymedigestion

在一个洁净的1.5ml离心管中混匀下列反应物：混合后37℃水浴1-2h。用酶切产物进行电泳注意事项：不要有气泡，并尽量使液体在离心管底部。质粒DNA的酶切分析反应物体积（µl)无菌去离子水10.010×M酶切缓冲液2.0质粒DNA6.0HindIII1.0EcoRI1.0总计20ul限制性内切酶酶分子识别位点切割位点限制作用是否需用ATPⅠ类

三亚基双功能酶二分非对称至少在识别位点外1000bpYesⅡ类内切酶与甲基化酶分子不在一起4-6bp,大多数为回文对称结构在识别位点中或靠近识别位点无特异性NoⅢ类二亚基双功能酶5-7

bp非对称在识别位点下游24-26bpYes限制性内切酶可分为三类限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基本工具。限制酶的切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割,

产生平末端的DNA片段；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端。限制性内切酶★平末端

在识别顺序的中心对称轴处切割5’G-G-C-C3’3’C-C-G-G5’5’G-G3’C-C-C-C3’-G-G5’HaeIII限制性内切酶★3’端粘性末端

在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3’末端切割。5’G-G-T-A-C-C3’3’C-C-A-T-G-G5’G-G-T-A-C3’CC3’C-A-T-G-GKpnI限制性内切酶5’G-A-A-T-T-C3’3’C-T-T-A-A-G5’GC-T-T-A-A5’5’A-A-T-T-CGEcoRI★5’端粘性末端

在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5’末端切割。5’A-A-G-C-T-T3’3’T-T-C-G-A-A5’AT-T-C-G-A5’5’A-G-C-T-TAHindIII限制性内切酶如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是：

EcoRⅠ：G↓AATTC

HindⅢ：A↓AGCTT目的片段400bp质粒大小为:2692bp+400bp=3092bp酶切片段大小为?双酶切限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFERBuffer的选择查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20ul。以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl

反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg

的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA。琼脂糖凝胶电泳DNAagarosegelelectrophoresis一、琼脂糖凝胶天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。

在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：一般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环。二、琼脂糖凝胶电泳原理染色溴化乙锭(EB):3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性。Gelview:荧光染料,在紫外光照射下呈现绿色荧光琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围胶浓度（％）线性DNA分子大小（kb）0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～3胶浓度越大，越适宜分离的DNA越小影响迁移速率因素

1、DNA的分子大小

2、琼脂糖浓度

3、DNA分子的构象

4、电源电压

5、嵌入染料的存在

6、离子强度影响

三、实验材料１．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。２．Gelview

：荧光染料,在紫外光照射下呈现绿色荧光３．TBE：５×TBE贮液2L：54gTris-base、

27.5g硼酸、20ml0.5M的EDTA(pH8.0)

加水至1L,用钱稀释10倍４．琼脂糖：1g5、DNAMarker5000DNAMarke