课题-多聚酶链式反应扩增DNA片段

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR技术简史1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖

PCR原理

细胞内参与DNA复制的各种组成成分

与反应条件

DNA复制的知识解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打开DNA双链模板合成子链原料催化子链合成使DNA聚合酶能从引物3’端开始连接脱氧核苷酸

思考：体内DNA复制的条件是什么？

DNA的合成方向DNA双链的方向，区分DNA的3′端和5′端DNA复制方向示意图DNA变性和复性示意图TaqDNA聚合酶的应用DNA聚合酶的特性，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链、而不能从头合成DNA高温导致DNA聚合酶失活课题2“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”Taq细菌的发现过程PCR技术与体内DNA复制的区别：

1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；

2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；

3.PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。PCR的反应过程一般采用变性-复性-延伸三步循环。

⑴变性：将模板DNA或延伸后的双链DNA加热到95℃，使双螺旋DNA解开成为单链。⑵复性：通过降低反应温度至55℃，使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3`端粘合。⑶延伸：将反应温度提高到约72℃，在耐热DNA聚合酶的催化下，合成两条互补链，从而使模板DNA扩增一倍。按照上述步骤重复操作约30次，即可将模板DNA扩增数百万倍。三、实验步骤：准备好PCR反应体系的配方用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液离心10分钟将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应注意事项：详见操作提示

四、结果分析与评价DNA含量的测定：稀释→对照调零→测定→计算（公式见P63）波长260nm处读数蒸馏水做对照50倍练习巩固1、关于PCR技术的应用，错误的一项是A古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学CDNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘D诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是A原理简单B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐热性D快速、高效、灵活、易于操作4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A