微生物耐药基础与临床之细菌耐药性检测

1细菌耐药性检测2细菌耐药性检测（监测）的目的预测细菌耐药性；为经验性治疗、感染控制、公共卫生指南的制定等提供信息。发现新耐药机制，新抗菌药物研发提供需求及作用位点，新诊断试验研发提供需求。教育医务人员、患者、大众。3细菌耐药性的发生过程：细菌获得与耐药相关的基因编码与耐药相关的蛋白表现出对某种抗生素的耐药基因水平蛋白水平敏感性4主要内容抗菌药物敏感性检测细菌耐药的生化检测细菌耐药的基因检测全国细菌耐药性监测网简介5基本概念及术语抗菌药物敏感性试验方法药物敏感对临床治疗的指导作用一、抗菌药物的敏感性试验6最小抑菌浓度（体外）的概念敏感、耐药、中介耐药（药物在体内的效力）的概念及临床意义折点质量控制一、基本概念及术语7

抗菌药物的敏感性试验

测定抗菌药物在体外抑制病原微生物生长效力的试验，称细菌对药物的敏感性试验，或称抗菌药物体外敏感性试验。

评价参数：最低抑菌浓度（Minimalinhibitoryconcentration，MIC）在体外能够抑制细菌生长的最低抗菌药物浓度。Antimicrobialsusceptibilitytest,AST8

最小抑菌浓度（Minimalinhibitoryconcentration，MIC）稀释度药物浓度抗菌药物在体内的浓度变化特点给药剂量不同，药物浓度不同；给药方式不同，药物浓度不同（药物的吸收）不同组织，药物浓度不同（药物的分布）不同时间，药物浓度不同（药物的清除）9复杂！剂量用法血清浓度感染部位浓度生物效应Pharmacokinetics

药动学（PK）Pharmacodynamics

药效学（PD）抗菌药物的药动学与药效学研究抗菌药物在体内吸收、分布和清除的动力学过程研究体内药物浓度与药物抗菌效果关系体外试验与体内情况有所不同体外：药物浓度固定不变体内：药物浓度随时间、组织的不同而变化11体外试验如何提示体内的疗效？药物在体内效力的概念：

敏感：提示治疗有效耐药：提示治疗无效

12某菌株能被某种抗菌药物抑制或杀灭，则该菌株对该抗菌药物敏感？反之则为耐药？抗菌药物在体内应用，还应考虑药物的剂量、药物在体内的代谢和机体的耐受性等。从本质上讲：细菌对某种抗菌药物是敏感还是耐药，常以该抗菌药物的治疗浓度与MIC的关系而定。常用剂量的抗菌药物通过常用途径所能达到的血药浓度。细菌对药物的敏感性与药物的治疗浓度血药浓度与疗效及毒性关系血药浓度0时间最高安全浓度最小有效浓度∞毒性作用治疗作用无效作用14

治疗浓度与MIC之间的关系

体内：治疗浓度体外：体内的抗菌效力

致死量

中毒浓度

最小中毒量

极量

R

治疗安

全范围

血药浓度

（常用剂量）

I

S

最小有效量

无效浓度

MIC

耐药中介耐药敏感15若MIC>最高治疗浓度，

则为“耐药”（Resistant,R）；若MIC﹤

最高治疗浓度的4~8倍，则为“敏感”（Sensitive,S）；若MIC〈最高治疗浓度的1~2倍则为“中度耐药”（Intermediate,I）或中度敏感依据抗菌药物的治疗浓度与MIC的关系，

确定药物在体内的治疗效力，

即细菌对药物是敏感、耐药或中介。1617耐药折点敏感折点18敏感折点：最高血药浓度的4~8倍，即表中的S耐药折点：最高血药浓度，即表中的R19

依据药物在体外的MIC值

判断药物在体内的抗菌效果常用治疗剂量血药浓度？药物机体内代谢给药途径等等数据比较20临床实验室标准协会临床实验室标准化协会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）是一个国际性的、跨学科、非盈利性的、制定标准的教育组织，它制定共识性的标准和指南“并促使这些标准在健康保健领域使用。在为临床试验与相关的医疗问题制定标准与指南时，CLSI实施了它所特有的达成一致的过程，因而得到全世界的认可。若要经济而有效地提供临床试验和医疗保健服务水平，就应具备一致的标准，这是CLSI的原则基础。21制定抗菌药物敏感试验的标准参考方法为标准检测方法提供质量控制参数为标准的抗菌药物敏感性试验方法建立解释标准为临床相关且经济的检查和报告策略提供建议通过新的或修订的方法、解释标准和质量控制参数的发展“不断地改进与完善新发现的耐药机制的检测方法和标准。

CLSI

药敏试验分委会的任务综合临床和实验室的数据22CLSI规定的药敏试验的方法？药敏试验的结果对临床的指导意义？临床医生如何解读药敏试验的结果？23抑菌试验方法：选择抗菌药物

特定的培养基，接种一定量的测试菌，

一定浓度的药物，培养一定的时间结果阅读：抑菌圈直径，最低抑菌浓度结果解释：敏感中度敏感耐药CLSI标准24（二）抗菌药物敏感性试验方法需氧和兼性厌氧菌专性需氧菌厌氧菌

抑菌试验杀菌试验联合药敏试验25按菌种和抗菌谱主要遵循CLSI制定的抗菌药物选择指南。

选药时做了多方面考虑，包括微生物学、临床药理学因素及美国FDA认可的临床适用性和疗效。

通常同类药物只选择1-2个代表品种；同时结合本单位、本地区常用的抗菌药物和常见病原菌的耐药现状。须与感染科医生、医院感染科协商，制定最合适的方案。抗菌药物的选择（合理、科学、经济、得当）26CLSI制定的抗菌药物选择指南

CLSI对各种细菌的药敏试验中宜测试的药物品种进行了推荐表中每格列的一组相似抗生素，疗效相似，不必重复选择。以“或”相连的药物，抗菌谱类似，表现为交叉耐药。因此，每格（一类或相关组）中的药物只需选择一种。27为使常规药敏试验合理，应限制测定药物的数量。预报药、指示药，而不是检测所用的药。选药指南

A组足以满足大多数临床实验室常规工作的需要。该表按特定菌或菌群分若干组，将各种抗生素择优次序排列，供常规实验室选择。28

B组包括了临床上重要的药物，特别是对院内感染，应该作为首选药。但是，报告是有条件的：

只有当A组中同类药物不敏感时才报告。

多部位感染；

药物敏感，明显副作用，或对A组药物治疗失败。29选药指南

C组包括替代或后备药物，

适用的情况包括：

治疗某些地方或流行性疾病，或对首选药物（特别是同类药，如β－内酰胺类或氨基糖苷类药物）多重耐药的菌株；

治疗对首选药物过敏的病人；

治疗不常见的菌种（如氯霉素治疗沙门氏菌或某些假单胞菌）等。30选药指南

D组包括仅限于泌尿系感染使用的药物（如呋喃妥因和有机酸类），其他部位感染的细菌无需测定。31选药指南

第二线药物（限制使用）：抗菌谱较广、疗效好，但!!不良反应较明显!!或价格较贵的药物，或近年来耐药发展较为迅速的品种，属控制使用。误区：二线药比一线药对身体损害小。抗菌药物的选择如对葡萄球菌的药敏试验应包括苯唑西林、青霉素、红霉素、克林霉素、复方磺胺甲噁唑(SMZ-TMP)和万古霉素；

此外根据情况可增加其他品种如氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、利福平和呋喃妥因等。32实验室应与传染科医生、药品委员会及医院感染科商讨，决定哪些药物作为常规（A组）报告，哪些只是作为选择性报告（B组）报告。选择性报告须有助于对该报告的理解，并促进降低由于滥用抗菌药物所造成的耐药菌增加。虽然B组药物的试验结果不作为常规报告，但是，一旦临床需要应该及时提供，或者对特定的标本作为常规报告。33药敏结果的选择性报告341、稀释法

•肉汤稀释法（试管稀释法）

•琼脂稀释法（平板稀释法）2、纸片扩散法（纸片法）3、E-试验4、联合药物敏感试验需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法

351、稀释法(dilutiontest)原理：以一定浓度的抗菌药物（一系列的对倍稀释）加入含有被测菌株的培养基，经培养后，观察细菌生长的情况。定量的药敏试验。检测值：

最小抑菌浓度：肉眼可见完全抑制细菌生长的最低药物浓度。Minimalinhibitoryconcentration，MIC

。

最小杀菌浓度：在体外能够使细菌总数减少(杀灭)99.9%以上的最低药物浓度。

minimalbactericidalconcentration，MBC36常量（宏量）稀释法试管，每一浓度药物一般2ml微量稀释法微孔，每一浓度药物一般0.1ml37操作方法培养基：Mueller-Hinton(M-H)肉汤药物原液的配制（不低于1000µg/ml或10倍于最高测试浓度）药物稀释：对倍稀释细菌接种：0.5麦氏浓度，5×105CFU/ml

（15分钟接种完毕）孵育：(35土2)℃，16～20h结果判断：MIC

肉汤对照；不含抗菌药的测试菌生长对照质量控制：质控菌的MIC应在CLIS允许的范围内colonyformingunit，CFU菌落形成单位

391ml蒸馏水MIC

40肉汤稀释法4；8；16；32；64；128；256ug/ml混

混清MIC？？41肠杆菌科质量控制质控菌株：即标准菌株，如大肠埃希菌ATCC25922接种浓度：细菌终浓度5×105CFU/ml培养基：M-H肉汤培养时间：16～18h若MIC在允许范围内则检测结果可信。ATCC是美国的一个微生物菌株保藏中心。每种已经定名的细菌都会有一个模式菌株，一般就是该种最早发现的那株菌株，称为标准菌株。待测菌不同，质控菌株、培养条件等也不同质控菌株对氧氟沙星的MIC质控容许范围金黄色葡萄球菌ATCC25923：0.12~1ug/ml大肠埃希菌ATCC25922：0.015~0.12ug/ml待测菌株对氧氟沙星的MIC结果解释标准抗菌药物耐药R敏感S氧氟沙星ug/ml≧8≦2药敏试验的质量控制：抑菌环范围有95%的可信区间，即20个试验的结果中只能≦1个结果超出表中所列范围。43培养基：MH肉汤药物原液的配制（不低于1000µg/ml或10倍于最高测试浓度）药物稀释：对倍稀释细菌接种：细菌终浓度5×105CFU/ml。（15分钟接种完毕）孵育：(35土2)℃，16～20h结果判断：MIC；MBC

肉汤对照；不含抗菌药的测试菌生长对照质量控制：质控菌的MIC如果肉汤稀释法实验操作不够规范，对MIC值有何影响？

超过了15分钟培养时间长了药物浓度高了44宏量稀释法：每管肉汤含量2ml微量稀释法：每孔肉汤含量0.1mlAMS微生物自动分析系统稀释法－－肉汤稀释法45微生物自动分析系统应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测试，卡片含有干燥的抗菌药物。制备一定浓度的菌悬液，接种到小卡上；放入孵箱，每隔一定时间，仪器自动检测细菌的生长情况，由计算机判定得出结果。46VITEK-32全自动微生物鉴定/药敏分析系统4748培养基：含一定浓度药物的M-H琼脂：细菌接种：每个接种点104CFU孵育：孵育：(35土2)℃

16～20h结果判断：

MIC

（菌落生长被完全抑制的最低药物浓度）质量控制：每个浓度药物的琼脂板应同时接种质控菌。质控菌的MIC在允许范围内2.琼脂稀释法特点：每个琼脂板可以同时检测多个菌体49琼脂稀释法

MIC:没有细菌生长的最低药物浓度。药物浓度163264128256ug/ml

50稀释法的特点定量的药敏试验，测定MIC、MBC。方法比较繁琐，手工操作，一般不作为常规试验，常用于调查罕见耐药。自动微生物鉴定药敏分析系统采用微量稀释法检测MIC。512、纸片扩散法（discdiffusiontest)

（Kirby-Bauer法）

原理：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平板上。抗菌药物向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围药物抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，形成抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对药物的敏感程度。二者呈正相关。与MIC值的关系？52

抑菌圈的大小与MIC呈负相关，抑菌圈愈大，MIC愈小。抑菌圈直径MIC的对数值53纸片法药敏试验抑菌圈直径与结果解释的标准抗菌药物与细菌

纸片含量抑菌圈直径：mm相应MICμg/ml

耐药中介度敏感耐药敏感丁胺卡那霉素30μg≤1415-16≥17≥32≤16氨苄青霉素

测肠杆菌

10μg≤1112-13≥14≥32≤8

测葡萄球菌

10μg≤28—≥29

测嗜血杆菌

10μg≤19—≥20≥4≤0.25

测肠球菌

10μg≤16—≥16≤254

操作方法：1.制备M-H琼脂平板，厚度4mm。2.制备0.5麦氏比浊管浊度的菌液（相当于5×107～108CFU/ml）（取培养16～24h，4~5个菌落配制）。3.菌液均匀涂布于平板。（15分钟接种完毕）4.无菌贴标准抗生素纸片于M-H琼脂表面，5.经过35℃16～24h孵育。6.量取抑菌环直径，7.质量控制：质控菌的MIC应在CLIS允许的范围内8.根据CLSI标准，报告细菌对该抗生素敏感、耐药、中介。质控菌株的抑菌圈直径的允许范围抗菌药物纸片含药量抑菌圈直径(mm)大肠杆菌金葡菌AMK30ug19～2620～26PEN10单位－20～37SXT1.25ug/23.75ug24～3224～32复方新诺明

药敏试验的质量控制：抑菌环范围有95%的可信区间，即20个试验的结果中只能≦1个结果超出表中所列范围。56纸片扩散法质量控制

培养基：M-H平板厚度，≧4mm细菌悬液：0.5麦氏标准的细菌浓度各抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。培养时间质控菌株57纸片扩散法质量控制

培养基：M-H平板厚度，≧4mm细菌悬液：0.5麦氏标准的细菌浓度各抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。培养时间质控菌株培养基厚了培养时间长了纸片的药效距离近了接种量58根据抑菌圈的直径，依照CLSI标准，作出敏感、耐药、和中介的判断。为‘‘定性”试验。CLSI推荐的最简单的药敏试验。（手工操作）纸片扩散法的特点593、E-试验（Epsilometertest，浓度梯度法）

原理E试条是一条5mm×50mm无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长的抗菌药物，另一面有判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有15～20个对倍稀释浓度的宽度范围。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的MIC。依照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。

256128801660无菌生长区有菌生长区E-试验结果解释61

椭圆形细菌生长抑制区2561288016判读抑菌浓度（MICug/ml)E-试验结果解释62E试验的特点方法、质量控制等与纸片扩散法相同优点连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好（相关系数为0.9）.可测MIC。操作简单，影响因素少，稳定性高。缺点：E试条较昂贵;

不适用于生长缓慢的苛养菌。63三种药敏试验方法的比较K-B法：

WTO推荐使用的最简单的药敏试验。稀释法：准确测定MIC、MBC，比较繁琐，试管法一般不作为常规试验。

微生物自动分析系统采用微量稀释法原理。E试验：可测定MIC。E试条较贵。64用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治疗，以扩大病原治疗的覆盖面治疗多种细菌所引起的混合感染对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生避免药物达到毒性剂量。4、联合药物敏感试验联合用药的临床意义65协同（增强）作用：两种抗生素联用的效果大于它们单独使用时的效果之和；20％～25％累加作用：它们联用时的效果等于单用两种抗生素效果之和；60％～70％无关作用：两种抗生素联用的效果，仅相当于其中一种具有较强作用的抗生素的效果；拮抗作用：两种抗生素联用时的效果反而小于它们分别使用时的效果之和。

10％～15％两种药物的联合使用的效果66无关作用协同作用拮抗作用累加作用67联合抑菌试验方法单药纸片搭桥法：定性试验棋盘稀释法：定量试验68单药纸片搭桥法两种含药纸片贴于（两药间距3~4mm）含菌琼脂表面，药物联合对被检菌作用可出现不同的图形。根据图形解释结果（为定性结果）。69单药纸片搭桥法70棋盘稀释法（定量试验）将甲乙两药的各种稀释度加以组合，组成联合药敏管。同时两种药物每一稀释度都有一只加单一药物的单独药敏管。药物浓度的选择：根据单一药物对被检菌的MIC和联合药敏管中的抑菌情况，可精确测定两药在适当浓度比例下所产生的相互作用。71（1）确定单药的MIC（2）确定联合药敏的药物稀释度联合药敏管单药终浓度开始于1或2倍的MIC用MH液体培养基将甲乙两药稀释6~8个稀释度棋盘稀释法试验步骤72（3）棋盘状排列无菌试管排列6排无菌试管，每排6支（4）加甲、乙两药（分别从横、竖排加入）每管各1ml，横排和纵排的第一管为无药对照，第一排为单药对照管（5）加待测菌液各管加入被检菌液0.01ml菌液终浓度：105CFU/ml73结果判读FIC：部分抑菌浓度指数甲药联合时MIC乙药联合时MICFIC=+

甲药单独时MIC乙药单独时MICFIC<0.5协同作用

0.5~1.0相加作用

1~2无关作用

>2拮抗作用

74新的药敏试验方法探索流式细胞术检测抗生素最低抑菌浓度分枝杆菌药物最低抑菌浓度的快速测定方法研究三、药敏试验对临床治疗的指导作用

药敏试验的结果与临床疗效的一致性？临床医生如何解读药敏试验的结果？75影响临床疗效的因素很多，据报道药敏试验

结果与临床疗效的符合率约为70%。药敏试验敏感菌株,临床治疗却无效药敏试验耐药菌株,临床治疗却有效76未检出致病菌体外药敏试验指导用药的局限性不可克服的折点判断标准问题

（只有血液判断折点）疗效指标与体外药敏指标不一致

（MIC与PK/PD在临床中的应用）药敏试验的结果与临床疗效的一致性？77致病菌判断不正确,

或者没有检出

检出的“病原菌”可能是污染菌、定植菌或混合感染中次要的病原菌。标本的采集及分离鉴定方法的正确！（临床见习时介绍）78致病菌判断不正确,

或者没有检出

一般医院检验科微生物实验室做细菌培养仅限于需氧非苛养菌的检测,

而对于厌氧菌、L

型细菌以及一些对氧或营养有特殊要求的细菌都不能培养出来。对于一些有正常菌群寄生的感染,

致病菌的判定是个难题,

需要检验者具备较丰富的经验,

致病菌判断错误,

药敏与药效不符也就难免了。现在的疾病多为合并感染，更应该通过科学的方法来筛选出敏感有效的药物。不可克服的折点判断问题目前CLSI制定的药敏判断标准是以药物进入体内后血液中最高浓度与该药物体外最低抑菌浓度（MIC）间的关系所制定。MIC<最高血液浓度4‐8倍为SMIC<最高血浓度1‐2倍为IMIC>最高血浓度为R79不可克服的折点判断标准问题

某些药物在个各局部组织分布浓度与血液不同，甚至高几倍或几十倍。局部用抗生素的药敏试验标准是什么?目前尚未能对局部用抗生素的体外药敏实验的结果与临床反应数据的相关性作出研究。80如何克服？临床医生应了解药物在体内的代谢及分布特征。药敏试验耐药，但治疗效果好！81200mg伊曲康唑一次剂量后各种内脏组织与血浆浓度的峰值比。口服本品200mg后4.6±1.3小时血药浓度达峰值，其血药浓度为0.32±0.16μg/ml。药敏试验耐药，但治疗效果好！82头孢曲松的药代特征(双通道排泄)

2/3原形由肾排出，1/3原形由胆道排出尿的峰浓度均值/血液的峰浓度均值=16.36倍

1gVi1-3h

胆汁:581mg/L(是血药浓度的10.56倍)总胆管胆汁:788mg/L(是血药浓度的14倍)胆囊:78.2mg/L(是血液的1.4倍药敏试验耐药，但治疗效果好！疗效指标与体外药敏指标不一致

PK:是指药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄。PD:是指药物剂量对药效的影响及药物对临床疾病的效果83药敏试验敏感，但治疗效果不好！往往是使用不当！MIC与PK/PD在临床中的应用

通过动物、人体的试验与体外抗菌作用相结合的试验，已证明只有游离的抗菌药物才有作用，

其杀菌作用有两种模式：

1.时间依赖性：对致病菌的作用取决与致病菌接触的时间。

如-内酰胺类、红霉素、克林霉素、TMP/SMZ等

2.浓度依赖性：对致病菌的作用取决于峰浓度。

如氟喹诺酮类、氨基糖苷类、甲硝唑等。848586体外试验与体内情况的关联PK/PD参数2次服药间血药浓度>MIC的时间用药后血清24h曲线下面积（areaundercurve）峰浓度87药物浓度高于MIC时间占给药间隔的百分比临床医生如何解读药敏试验的结果？

88医生一般认为，药敏试验检验报告单中列出的药物敏感性结果就是可供选择的药物，而报告单中未出现的药物没有选用的依据，这种观点是不全面的。事实上，报告单可以表达的内容远多于报告单字面含义。89二、细菌耐药的生化监测90细菌耐药性产生的生化机制细菌产生灭活酶灭活抗生素细菌改变抗菌药物作用的靶位细菌降低通透性阻止或减少抗生素进入菌体细菌增强主动外排系统把进入菌体的抗生素泵出菌体外细菌生物被膜的形成91革兰阳性菌的β-内酰胺酶

青霉素酶。90%的葡萄球菌菌株能产生青霉素酶底物谱：青霉素G；

92革兰阴性菌的β-内酰胺酶

青霉素酶、超广谱β-内酰胺酶、头孢菌素酶

金属β-内酰胺酶可由染色体、质粒介导。易于传播。是G－菌最危险的耐药形式。93β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶（参考）

酶抗生素青霉素酶超广谱β-内酰胺酶AmpC酶金属β-内酰胺酶青霉素类分解分解分解分解头孢菌素类稳定分解（除第三代）分解（除第三、四代）分解碳青霉烯类稳定稳定稳定分解被酶抑制剂所抑制能能不能被EDTA抑制

94生物化学技术检测酶的等电点(等电聚焦电泳)头孢哨噻吩滤纸片法碘淀粉测定法分析酶的底物谱及抑制物谱纸片法和稀释法β－内酰胺酶检测951.头孢哨噻吩滤纸片法—检测头孢菌素酶（AmpC酶），

用接种环挑取受试菌于头孢哨噻吩滤纸片上(商品化)，10分钟内由黄色转变为红色即阳性结果，表示头孢菌素的β－内酰胺环被酶打开。962.碘淀粉测定法

—

检测青霉素酶受试菌混于青霉素溶液，振摇30分钟。加入淀粉液后，再加入碘液，溶液变蓝，继续振摇。10分钟之内蓝色消失者为产酶株。β-内酰胺酶青霉素青霉素噻唑酸碘碘淀粉复合物转变为无色97(1)．纸片法--初筛：培养基：Muller-Hinton琼脂药敏纸片接种：按标准纸片扩散法孵育：35℃大气环境，16-18小时结果：头孢泊肟（10ug／片）抑菌环≤22mm

头孢他啶（10ug／片）抑菌环≤22mm

氨曲南（30ug／片）抑菌环≤27mm

头孢噻肟（30ug／片）抑菌环≤27mm

头孢曲松（30ug／片）抑菌环≤25mm3.分析酶的底物谱及抑制物谱超β-内酰胺酶检测纸片扩散法可能产生ESBL

超β-内酰胺酶检测98(1)．纸片法--确证试验：培养基：Muller-Hinton琼脂药敏纸片浓度：头孢噻肟30ug、头孢噻肟/棒酸30ug/10ug

头孢他啶30ug、头孢他啶/棒酸30ug/10ug接种：按标准纸片扩散法孵育：35℃大气环境，16-18小时结果：混合棒酸药物纸片的抑菌圈直径比无棒酸药物纸片的直径

大5mm以上者为产ESBL菌。超广谱β-内酰胺酶的底物超广谱β-内酰胺酶的抑制剂99混合棒酸药物纸片无棒酸药物纸片的直径直径差﹥5mm：ESBL100头孢他啶（30ug／片）、头孢他啶／克拉维酸（30／10ug）；头孢噻肟30ug、头孢噻肟／克拉维酸（30／10ug）抑菌圈直径差﹥3.5mm时，即判定为产ESBL菌株。101

筛选试验：选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松至少2种以上，用阳离子增强的MH肉汤(标准肉汤稀释法)稀释至1mg/L,凡被测菌在上述各管中能够生长(MIC≥2μg/ml)，高度怀疑为ESBLs，应进一步作确认试验来加以确诊。（2）液体稀释法102

确认试验：用标准肉汤稀释法测定MIC的方法,头孢噻肟单独稀释(0.25～64mg/L)及头孢噻肟(稀释范围相同)加克拉维酸(每管4mg/L);

头孢他啶单独稀释(0.25～128mg/L)及头孢他啶加克拉维酸(每管4mg/L),

上述2种药物必须同时进行试验,结果加克拉维酸和不加克拉维酸的

MIC差值≥8倍(3个稀释度)，可确认为ESBLs菌株。（2）液体稀释法金属β-内酰胺酶检测EDTA协同过筛法金属β-内酰胺酶的底物：碳青霉烯类金属β-内酰胺酶的抑制剂：EDTA用EtestESBL试条测定

104104CT：头孢噻肟，TZ：头孢他啶105细菌生物被膜的检测临床常见生物被膜菌细菌生物被膜的培养细菌生物胞膜的定量分析106生物被膜菌的临床感染细菌容易在惰性表面或是坏死组织以及体内医疗装置如子宫内避孕器、导尿管等上形成菌膜；以至引发大量的医源性感染。如果细菌在体内植入物如等上形成菌膜后造成感染，则即使用上千倍剂量的现有药物来治疗也是无济于事，而不得不将植入物从体内移出。菌膜也能在活组织上形成。107细菌生物被膜的形成速度缓慢，由菌膜引起的感染出现明显症状的时间较长。但当在菌膜内释放出的细菌，则可引起急性感染。生物被膜的形成是许多慢性和难治性感染疾病的反复发作的主要原因。生物被膜菌的临床感染108有关涉及菌膜感染的部分例子感染或疾病形成菌膜的细菌牙龋产酸革兰氏阳性球菌（如链球菌）牙周炎革兰氏阴性厌氧口腔细菌中耳炎非典型流感噬血杆菌肌骨骼感染革兰氏阳性球菌（如葡萄球菌）坏死性筋膜炎A组链球菌胆道感染肠细菌（如大肠埃希氏菌）骨髓炎多种细菌和真菌，通常是混合感染细菌性前列腺炎大肠埃希氏菌和其它革兰氏阴性细菌Nativevalve心内膜炎Viridans组链球菌囊纤微化肺炎铜绿假单胞菌及洋葱克雷伯氏菌Meloidosis类鼻疽假单胞菌109医院内感染监护病房肺炎缝术Exitsites动静脉分流术Schleralbuckles无形眼镜泌尿导管膀胱炎腹膜透析腹膜炎宫内节育器气管内管Hichman导管中枢神经导管机械心脏阀血管移植胆道stent阻滞矫形外科装置阴茎假体形成菌膜的细菌革兰氏阴性杆菌表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌铜绿假单胞菌和其它革兰氏阳性球菌大肠埃希氏菌和其它革兰氏阴性杆菌各种细菌和真菌衣氏放线菌和其它许多菌各种细菌和真菌表皮葡萄球菌和白念珠菌表皮葡萄球菌和其它细菌金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌革兰氏阳性球菌各种肠道细菌和真菌金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌110细菌生物被膜的培养静态培养组织培养板，硅胶片，玻璃片液体培养基（稀释），定时换液连续培养

内循环三相流化床的生物被膜的培养

染色：结晶紫染色，硝酸银染色

111PA生物被膜的72h培养物。结晶紫染色；95％乙醇脱色10min；用紫外分光光度计检测每孔脱色液在570nm光波的吸收值(OD570nm)。细菌生物被膜的定量分析112（y＝1.1602x+0.9976，R2＝0.8944，r＝0.944）YangWQ,ShiL,JiaWX,etal.Evaluationofthebiofilm-formingabilityandgenetictypingforclinicalisolatesofPseudomonasaeruginosabyenterobacterialrepetitiveintergenicconsensussequencePCR.MicrobiologyandImmunity,2005,49:1057-1061.113Thebiofilm-formingabilityandgenotypeofP.aeruginoseisolatesBiofilmformationTotal(percentage)None(-)7(14.6％)Weak(+)15(31.3％)Moderate(++)19(40.0％)Strong(+++)7(14.6％)OD570nm≤0.3：“－”，0.3＜OD570nm≤1.0：“＋”，1.0＜OD570nm≤2.0：“＋＋”，2.0＜OD570nm：“＋＋＋”。114生物被膜菌感染的治疗近年来开发的新型大环内酯类如克拉霉素、阿奇霉素等，具有很强的细胞内穿透作用，对生物被膜菌有杀灭作用。大环内酯类抗生素在治疗铜绿假单胞菌生物膜感染中具有举足轻重的作用，可将大环内酯类抗生素如阿奇霉素作为“增效剂”联合其他对铜绿假单胞菌敏感的抗菌药如喹诺酮类、β-内酰胺类抗生素。115大环内酯类药物与β-内酰胺类抗生素联用

治疗生物被膜菌感染大环内酯类药物可抑制BF主要成份多糖蛋白复合物的合成酶，妨碍多糖蛋白复合物的形成，破坏BF结构，有利于β-内酰胺类抗生素渗透，发挥强大的杀菌作用，将细菌清除。大环内酯类药物还可降低杀菌剂杀菌时细菌裂解内毒素的释放量，减轻肺和全身炎症反应的过程，改善临床症状，从而达到良好的临床效果。两者合用相得益彰。116三、细菌耐药基因检测基因检测细菌耐药性的优缺点细菌耐药基因检测方法基因检测方法的应用117基因检测细菌耐药性的优点：能早期指导临床医生治疗用药。分子遗传学方法可以直接从临床标本入手，无需菌株的培养，极大地节省了时间，减轻了实验室的生物危险性。有助鉴别那些处于中介水平或常规药敏结果模棱两可的结果。分子生物学方法被认为是“金标准”。在细菌耐药性的流行病追踪调研中，耐药基因检测比抗生素敏感方法更准确。发现新的耐药基因。118基因检测方法检测抗生素耐药性的缺点：当样品中菌量很少时，其敏感性会大大降低。对每一个测试的抗菌药物，均需要设计相应的分子检测方法，一次只能检测一种耐药机制。目前仍有许多耐药机制是未知的，无法进行分子检测。耐药基因的检测也会存在假阳性问题。对许多耐药基因的检测方法，目前还缺乏临床对照研究以评价其准确性、重复性及临床应用价值。119常见的细菌耐药相关基因举例基因耐药抗生素细菌种类基因大小bpAnt(4’）氨基糖苷类金黄色葡萄球菌473ant（6’)-la氨基糖苷类粪肠球菌470mecAβ－内酰胺类金黄色葡萄球菌400blaTEMβ一内酰胺类大肠埃希菌424catD氯霉素艰难杆菌270整合子基因盒120耐药基因检测方法：分子方法检测耐药基因的基础是PCR。在PCR基础上发展出来的方法：分子杂交、逆转录PCR、

DNA序列分析，多重PCR、基因微振列技术、实时定量PCR。

PCR限制酶切片段多态性(RFLP)、

PCR-单链构象多态性(SSCP)

细菌耐药基因芯片检测技术（基因微振列技术）。

121基因芯片技术芯片制备：以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。样品制备：生物样品往往是复杂的生物分子混合体，须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。杂交反应：即荧光标记的样品与芯片上的探针进行反应产生一系列信息的过程。信号检测和结果分析：杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。122结核杆菌耐药与基因突变异烟肼耐药株：过氧化氢酶－过氧化物酶基因

katG

突变利福平耐药株：

RNA聚合酶B亚基的编码基因rpoB突变链霉素耐药株：核糖体蛋白编码基因rpsL

或16SrRNA编码蛋白突变吡嗪酰胺耐药株：编码吡嗪酰胺酶的基因pncA突变乙胺丁醇耐药株：耐乙胺丁醇与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embB

操纵子突变123结核菌耐药基因突变检测液芯124关于细菌耐药性分子机制研究耐药表型及流行病学分析耐药基因的检测及流行病学分析耐药表型与基因的相关性分析16095条125四、特殊耐药菌的检测及临床意义耐甲氧西林葡萄球菌检测耐青霉素肺炎链球菌检测耐万古霉素肠球菌检测超广谱β-内酰胺酶肠杆菌科细菌检测126MRS：

MethicillinResistantStaphylococcusMRS临床意义检测方法（一）耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)检测127甲氧西林、奈夫西林和苯唑西林等为对青霉素酶稳定的半合成青霉素这类药物针对青霉素敏感的葡萄球菌和各种链球菌的抗菌作用则较青霉素弱，临床主要用由耐酶葡萄球菌引起的感染。葡萄球菌对甲氧西林、奈夫西林和苯唑西林药物的耐药，称甲氧西林耐药，即使甲氧西林现在已不再是试验或治疗药物，但仍普遍使用缩写。耐甲氧西林葡萄球菌MRS

MethicillinResistantStaphylococcus128耐甲氧西林葡萄球菌MRS包括两类细菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSAMethicillinResistantStaphylococcusAureus耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌

MRCNSMethicillinresistantcoagulasenegativestaphylococcus129对于MRS，不论其体外药敏试验结果，所有的β