临床免疫学检验：4 沉淀反应、免疫电泳

沉淀反应(precipitationreaction)概念：

可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质存在，两者比例恰当时，可出现肉眼可见的沉淀现象。

Ag沉淀原Ab

沉淀素(precipitin)实验中为使抗原抗体比例（数量）恰当，应稀释Ag分类：液体内沉淀反应：絮状沉淀试验、环状沉淀试验免疫浊度测定法凝胶内沉淀反应：双向琼脂扩散试验、单向琼脂扩散试验等凝胶免疫电泳：免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳等一.液体内沉淀试验（一）絮状沉淀反应

(flocculation)抗原、抗体特异性结合，在电解质存在的情况下出现肉眼可见的絮状/块状沉淀既可在试管内进行，也可在玻片上进行。用于：玻片法常用于定性测定

试管法:半定量测定在沉淀反应前，应测试抗原、抗体间最适比例，方法有抗原稀释法、抗体稀释法、方阵滴定等。方阵最适比测定抗体抗原稀释度稀释度———————————————————1/101/201/401/801/1601/3201/6401/1280对照

1/5++++++++++++±－－

1/10+++++++++++++－－

1/20++++++++++++－－

1/40－±++++++++++－

1/80－－－－++++－（二）环状沉淀反应方法：在环沉管（0.2×3cm)中进行。

先加已知Ab，再加待测Ag。静置30min后观察Ag、Ab液面交界处是否有白色沉淀环，若有，为阳性）。用途：用于微量抗原检测（法医学上血迹鉴定等）

环状沉淀试验1.毛细玻管，内径1.5~2mm2.下层置血清（Ab），上层加Ag（不能颠倒）抗原、抗体相对应，比例适当，即形成沉淀环（三）免疫浊度测定(immunoturbidimetry)免疫浊度测定原理可溶性Ag与相应Ab特异性结合，二者在比例合适及增浊剂PEG作用下，可快速形成AgAb复合物，使反应液出现浊度。使用浊度计检测相应浊度，浊度高低与复合物含量成正比。绘制标准曲线，根据浊度推算样品中Ag含量。优点：敏感、快速、定量测定

免疫浊度测定的影响因素Ag/Ab的比例：Ag/Ab比例合适是形成浊度的关键。

Ag过剩，形成的IC分子小，易发生再解离，使浊度↓；

Ab过剩，出现前带现象至等价带Ab的质量：特异性强（不出现交叉反应）；效价高（＜1:20易产生非特异性浊度）；与Ag亲和性强Ag/Ab反应的环境：

合适的PH6.5~8.5；离子强度大（PBS作为反应液）增浊剂（促聚剂）：PEG、Tween-20可促进IC快速形成免疫比浊方法分类

透射免疫比浊散射免疫比浊胶乳免疫比浊1.透射免疫比浊法原理：

缓冲液中，先加入已知过量Ab，然后加入待测Ag，AgAb复合物的量随Ag量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列标准品对照，即可算出未知Ag含量。优点：该法操作方便、检测快速。临床上多用于检测IgG、IgA、IgM、C3、C反应蛋白（CRP）等。缺点：所需Ag/Ab量大。

2.胶乳免疫比浊法原理：

将已知Ab吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应Ag时，使胶乳颗粒发生凝集，减少透光度。透光度减少程度与胶乳凝聚成正比，当然也与Ag量成正比。本法不易选择适用的乳胶，同时Ab与胶乳结合也困难。二.凝胶内沉淀试验

在凝胶介质（琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶）中进行的沉淀反应原理

可溶性抗原与相应抗体在电解质存在下，在琼脂基质中扩散，当两者相遇，比例恰当时结合，可出现肉眼可见的沉淀线/沉淀环。（一）双向琼脂扩散试验

（简称双扩

doubleimmunodiffusion)方法：制琼脂板(3ml1.5%NS琼脂）打孔（双孔型/三角孔型/梅花孔型）加样（平孔沿加满）扩散（37C、24h观察结果）

双向琼脂扩散试验抗原抗体抗原抗体结合沉淀线用途：1.已知Ag或Ab检测未知Ab或Ag的浓度及分子量：双孔型2.抗原性质分析：三角孔型3.测Ag有效稀释度或

Ab的效价：梅花孔型4.鉴定Ag或Ab纯度：一条沉淀线，纯；多条沉淀线，不纯测未知抗原或抗体：双孔型

抗原性质分析：三角孔型

测Ag有效稀释度：梅花孔型优点：简单、易行，用途广缺点：

敏感性低出结果慢只定性，不能精确定量（半定量）（二）单向琼脂扩散试验(简称单扩

singleimmunodiffusion)方法：

已知定量Ab+琼脂制板、打孔在琼脂板小孔中加入待测的梯度AgAg向四周扩散形成沉淀环

Ag浓度与沉淀环直径呈线性关系绘制标准曲线

从标准曲线上查出并计算待测标本含量12345待测标本单向琼脂扩散试验Ag的沉淀环注：1~5孔为抗原不同梯度形成的免疫沉淀环沉淀环直径cmAg含量（浓度）单向琼脂扩散试验标准曲线图Ag浓度沉淀环直径用途：定量测定抗原，如测IgG、IgA、IgM、C3等含量

三.免疫电泳技术(agargelimmunoelectrophoresis)在电场作用下进行的凝胶扩散电泳技术：带电胶体颗粒在电场中向相反电极泳动，利用电泳现象研究某些化学组分的分离技术免疫电泳技术的优点：1.加快反应速度2.规定了抗原、抗体扩散方向，提高反应敏感度3.可将某些带电性不同的蛋白组分先分开，再与抗体进行抗原抗体反应影响电泳的因素：1.与溶液的pH有关：常用pH8~9，蛋白质带负电2.与溶液离子强度有关：愈高，泳动慢，一般0.02~0.2M3.与电场强度有关：愈高，愈快，一般4~6v/cm（琼脂长），约40v左右4.电渗作用的影响电渗作用：电场中液体对于一固体的固定相对移动的现象。电渗方向与电泳方向相反。

（一）对流免疫电泳（counter-immunoelectrophoresis)原理：定向加速的免疫双扩

（双扩＋电场，使抗原、抗体相对泳动）方法：

抗原、抗体分别在琼脂板上不同孔内，抗原在负极端，抗体在正极端，电泳。电压：4~6v/cm(琼脂长度）电泳时间：45分钟~1小时-抗原抗体对流免疫电泳PH：8.6BB缓冲液

Ag：-，借助电泳由负向正极运动；

Ab：-少，分子大，重，电泳慢，因电渗反而由正向负极运动。优点、用途：

简便、快速；反应敏感度达μg/ml

常用于Ag/Ab的效价及纯度鉴定（二）火箭免疫电泳（rocketimmunoelectrophoresis)原理：

单扩＋电场，为定量试验方法：

已知定量Ab+琼脂混合，制板在玻板一端打孔、加梯度Ag

电泳根据所知样品梯度含量绘制标准曲线

查出待测样品含量-+火箭免疫电泳12345待测优点与用途：

与单扩相同，已知Ab定量检测Ag（IgG/IgA/IgM），时间短，敏感度高（ng/ml）。（三）免疫电泳（immunoelectrophoresis)

多用于分析复杂抗原组分原理：

Ag区带电泳＋双扩结合方法：

1.Ag电泳分出区带

2.Ag、Ab免疫双扩用途：常用于分析复杂Ag的组分。（如人全血清组分的分析）-+病人血清中缺少这条沉淀线双扩时加Ab的小槽人血清免疫电泳后的结果（有的病人缺少某一条沉淀线，有的病人会出现多一条不该有的沉淀线，均为异常）正常人血清病人血清优点：

用样品量小特异性高分辨力强缺点：

由于复杂抗原中各成分含量差异大，不能全部显出，敏感性不高。用途：

分析复杂抗原组分