第三章分子荧光光谱法w

1第三章分子荧光光谱法MolecularFluorescenceSpectrometry2分子荧光光谱法3.1背景概述3.2分子荧光的产生过程荧光的激发光谱和发射光谱3.3影响荧光强度的因素3.4分子荧光光谱仪3.5分子荧光光谱法的应用

某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时间内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间比较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿物

萤石(fluospar)而得名。 我们这里要介绍的荧光，是指物质在吸收紫外光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光。 除了紫外光和可见光可能激发荧光外，其它的光如红外光、X射线也可能激发出荧光，因此除紫外荧光或可见荧光外，还有红外荧光、X射线荧光等。3.1背景概述4分子荧光光谱是一种发射光谱分析方法。分子荧光光谱法

分子吸收能量后，从基态跃迁到激发态。激发态通常是不稳定的，会释放能量而产生跃迁回到基态，如果是以光辐射的形式释放能量，就称为发光。相应的光谱分析法就称为分子发射光谱法。分子荧光是一种光致发光过程。荧光是指一种光致发光的冷发光现象。荧光物质吸收外界高能光辐射（如紫外、X射线、日光短波段）后，导致内部电子能级跃迁，重新释放出低能长波光，即为荧光；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。夜光通常指不用外界电能或使物体处于高温状态而发出的光，与冷光类似。如直接由化学能激发的荧火虫发光、鬼火等，以及由放射性元素衰变产生的高能射线激发的荧光和紫外、X射线、日光短波段等高能光辐射激发的荧光。夜光包括荧光。光致发光

物体依赖外界光源进行照射，从而获得能量，产生激发导至发光的现象。它大致经过吸收、能量传递及光发射三个主要阶段，光的吸收及发射都发生于能级之间的跃迁，都经过激发态。而能量传递则是由于激发态的运动。紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光。如磷光与荧光。光致发光最普遍的应用为日光灯。它是灯管内气体放电产生的紫外线激发管壁上的发光粉而发出可见光的。其效率约为白炽灯的5倍。磷光是一种缓慢发光的光致冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线）照射，吸收光能后进入激发态（具有和基态不同的自旋多重度），然后缓慢地退激发并发出比入射光的的波长长的出射光，而且与荧光过程不同，当入射光停止后，发光现象持续存在。发出磷光的退激发过程是被量子力学的跃迁选择规则禁戒的，因此这个过程很缓慢。分子荧光光谱法的特点①灵敏度高

荧光分析是由试样溶液所发生的荧光的强度来测定试样溶液中荧光物质的含量。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及荧光分光光度计的灵敏度有关．因此荧光分析的灵敏度高于一般的分光光度法．最低检出限比分光光度法低一个数量级以上，适合于痕量物质的检测。②选择性好。凡是会发生荧光的物质首先必须会吸收一定频率的光，但会吸收光的物质却不—定会产生荧光。对于某一给定波长的激发光，产生荧光的物质发出的荧光波长也不相同，只要控制荧光分光光度计中激发光和荧光单色器的波长便可得到选择性良好的方法．③能够引起荧光的化学物质较少，应用范围小。大多数物质本身不会产生荧光，一些物质在加入某种试剂后能够产生荧光。10

1.分子能级与跃迁

分子能级的每个电子能级上，都存在振动、转动能级；

3.2分子荧光的产生过程基态→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；单重态：一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。

大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且自旋方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所以大多数分子在基态时处于单重态。当分子受光照射时，若光子能量恰好等于分子的某两个能级的能量之差，则分子吸收光子并从基态跃迁到第一激发态或更高的激发态中的某个振动能级。但其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。持续一段时间后，激发态电子的自旋可能倒转，生成三重态。单重态能级间的跃迁符合光谱选律，跃迁概率大。分子通过吸收辐射而直接被激发到三重态的跃迁是禁阻的，概率很小。2激发态分子的失活:

激发态分子不稳定，以辐射或无辐射跃迁的方式回到基态。

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电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量，这个过程即为分子的去激发过程；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁3.分子的去激发过程15S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫振动弛豫：由于分子间的碰撞，激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。

激发态分子常常首先发生振动驰豫。内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。

①无辐射跃迁

系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。含有重原子的分子中（如I、Br等），系间窜跃最常见。

外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用和能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭或猝灭。

②辐射跃迁荧光：受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到达第一电子激发单重态的最低振动能级，以辐射的形式失活回到基态，发出荧光。

由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧光的能量比吸收的能量小，即荧光波长一般比激发光波长长。磷光：若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。由于激发三重态能量较激发单重态低，所以磷光的波长比荧光的波长稍长。磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷光很少应用于分析。4.荧光产生的过程：（1）处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；（2）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过无辐射跃迁降落到第一电子激发态的最低振动能级；（3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光：（4）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级．5.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构。只有少数具有某些结构特性的体系才会产生荧光现象。①大的共轭π键结构；②刚性的平面结构；③取代基团为给电子取代基。（2）具有一定的荧光量子产率。

判断荧光生色团的标准判断化合物能否产生荧光，可以从以下几个方面来分析：碳原子骨架：具有共轭双键体系的分子容易产生荧光。绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环。任何有利于电子共轭度的结构变化都将提高荧光效率，或使荧光波长红移。分子的几何排布：具有刚性平面结构的有机分子容易发荧光。平面构型或分子刚性增加，荧光增强。取代基的类型和位置。环境、溶剂、温度、pH等均会影响分子结构，从而影响荧光。荧光探针总的来说，天然的荧光生物分子种类很有限，而且荧光强度较弱，为了研究多数的不发光的生物分子，人们广泛利用一类能产生稳定荧光的分子，把这些小分子和大分子结合起来，或者插入大分子中，根据这些较小的荧光分子性质的改变，分析大分子的结构，这类小分子称为荧光探针。6荧光与分子结构的关系

电子跃迁类型

*→的荧光效率高，系间窜跃至三重态的的速率常数较小，有利于荧光的产生。共轭效应含有*→跃迁能级的芳香族化合物的荧光最常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能产生荧光。取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基会使荧光增强。

平面刚性结构效应

可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。7荧光与荧光量子产率Φ

物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：Φ与失活过程的速率常数k有关：凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F）与①荧光物质的吸光程度及其②发射荧光的能力有关：

F=K′（I0—I）

I0

—入射光辐射强度；I

—透射光辐射强度；

K′—取决于荧光量子产率（Ф）。8.荧光强度与浓度的关系Lambert-Beer定律：=溶液浓度较低时：

当入射光的λ1和I0一定时：

F=Kc

即：

在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。

————这是荧光法定量的基础。

（1）内部因素自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。自吸收——荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光谱的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，从而使荧光被减弱。荧光强度F与光源的辐射强度I0有关，因此增大光源辐射功率I0可提高荧光测定的灵敏度。紫外-可见分光光度法无法通过改变入射光强度来提高灵敏度。3.3影响荧光强度的因素32

荧光猝灭

荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互作用，使荧光强度减弱的作用称为荧光猝灭。包括碰撞猝灭、氧的猝灭、浓度（自）猝灭和自吸收等。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。33碰撞猝灭

是由处于激发单线态的荧光分子与猝灭剂碰撞后，使激发态分子以无辐射方式返回基态所造成的。

碰撞猝灭随溶剂粘度的增大而减小，随温度升高而增加。34

氧的猝灭

溶液中的溶解氧常对荧光产生猝灭作用，这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单线激发态的荧光分子相作用，促进形成顺磁性的三线激发态分子，加速系间跨跃所致。

因此在较严格的荧光实验中，一般需要通氮除氧。353.3影响荧光强度的因素

浓度（自）猝灭

当荧光物质的浓度较大时，会产生自猝灭现象。

最简单的情况是激发态的分子与未激发的分子碰撞而使能量降低引起的。

通常，液态纯物质的荧光都不强。36

自吸收

荧光物质的荧光光谱曲线与吸收光谱曲线重叠时，基态分子将吸收荧光物质所发出的荧光而产生自吸收。（2）环境因素

①温度

温度对荧光的影响很大。

温度升高，荧光强度减弱的原因主要是溶液的粘度减小，溶剂与溶质分子的动能增加，使得荧光分子的其它分子之间的碰撞几率增加，激发态荧光分子通过分子间碰撞或分子内能量的转移，将自己的能量转移出去。以非荧光发射的形式回到基态，这就造成荧光淬灭、量子产率降低的情况。如果溶液中有淬灭剂存在，则淬灭剂的作用也会随温度升高而增大。温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率，因此会增加荧光强度。例如：荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光产率增加3%，当温度降低至-80℃时，荧光产率为100%。为减少温度对荧光强度的影响，可采用恒温样品架维持样品温度的恒定。

38(2)

pH的影响对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言，溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的影响。

因此在荧光测量中往往需要控制溶液的pH值。pH<5无荧光5~12蓝色荧光>12无荧光

苯胺阳离子苯胺分子苯胺阴离子393.4分子荧光光谱仪荧光光谱仪是由光源，激发单色器，样品池，发射单色器，检测器及记录系统等组成。光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器403.4分子荧光光谱仪

光源发出的光经激发单色器分光后得到特定波长激发光，入射到样品使荧光物质激发产生荧光，通常在90度方向上进行荧光测量。光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器

发射单色器与激发单色器互成直角。经发射单色器分光后使荧光达到检测器而被检测。41荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制发射单色器3.4分子荧光光谱仪42紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制荧光分光光度计:光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器3.4分子荧光光谱仪43二.光源1.光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命3.4分子荧光光谱仪44常用气体放电灯类型：

氙灯光源高压汞光源3.4分子荧光光谱仪45三.单色器激发单色器，

用于荧光激发光谱的扫描及选择激发波长；发射单色器，

用于扫描荧光发射光谱及分离荧光发射波长。3.4分子荧光光谱仪46五.样品池问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？四.检测器光电倍增管电荷偶合元件检测器

3.4分子荧光光谱仪47紫外-可见分光光度计

测量池(吸收池)荧光分光光度计样品池I0ItI0ItIF,p1.材料：紫外-可见分光光度计——石英池、玻璃池荧光分光光度计——石英池

2.形状：紫外-可见分光光度计的吸收池——两面透光荧光分光光度计的样品池——四面透光493.5分子荧光光谱法的应用

分子荧光光谱法具有高的灵敏度和好的选择性。一般而言，与紫外－可见分光光度法相比，其灵敏度可高出2－4个数量级，其检测下限通常可达0.1～0.001

gcm-3。荧光分析法的应用广泛，可测定60余种元素，尤其适合对生物大分子的检测。此外，还可作为高效液相色谱及毛细管电泳的检测器。503.5分子荧光光谱法的应用（1）荧光强度与浓度的基本关系式1.荧光定量分析光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相应的吸光分数为：51荧光强度（IF）与吸收的激发光的光强及量子产率成正比：按照级数展开式：3.5分子荧光光谱法的应用52对于稀溶液，当bc<0.02时：IF----荧光强度F-----荧光量子产率b--吸收光程--摩尔吸光系数C--荧光物质浓度当I0一定时，3.5分子荧光光谱法的应用53低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系，高浓度时，由于自熄灭和自吸收等原因，荧光强度与物质的浓度不呈线性关系3.5分子荧光光谱法的应用543.5分子荧光光谱法的应用（2）单组分的荧光测定

测定方法

直接测定法：适用于有荧光的物质间接测定法：适用于不发生荧光，或荧光量子效率很低物质。

第一种间接方法是利用化学反应使非荧光物质转变为荧光物质；第二种间接方法是荧光猝灭法。若被测物质具有荧光猝灭剂的作用，可测量荧光强度的降低来测定该荧光物质的浓度。

55563.5分子荧光光谱法的应用无机化合物

利用金属离子，如铍、铝、硼、镓、硒、镁及某些稀土元素等，与有机试剂形成荧光配合物来进行荧光分析。

具体如下：57与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定3.5分子荧光光谱法的应用583.5分子荧光光谱法的应用几种常用的荧光试剂试剂测定的元素安息香B,Zn,Ge,Si2,2’-二羟基偶氮苯Al,F,Mg2-羟基-3-萘甲酸Al,Be8-羟基喹啉Al,Be593.5分子荧光光谱法的应用有机化合物荧光分析可测定许多类有机化合物，在临床、生物化学和环境保护等领域中十分重要。芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测