分子生物学与慢性粒细胞白血病

分子生物学与慢性粒细胞白血病一、概述慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)简称慢粒。概念：是一种发生在早期多能造血干细胞上的恶性骨髓增殖性疾病（获得性造血干细胞恶性克隆性疾病)。Chronicmyelogenousleukemia,chronicphase.2021/4/272病因：CML的病因比较复杂，较为公认的致病因素是电离辐射，如X射线、γ射线等。暴露于辐射的人群有较高的CML发病率。日本广岛及长崎原子弹辐射后，慢粒的发病率较未照射人群高17倍。主要特点：本病病程发展缓慢，外周血粒细胞显著增多且不成熟，脾脏明显肿大。自然病程可经历慢性期、加速期和急变期，多因急性变而死亡。本病各年龄组均可发病，以中年最多见。2021/4/273二、CML分子生物学发病机理Ph染色体与融合基因

90%以上的慢粒患者中可发现有Ph染色体，即t(9；22)(q34；q11)，9号染色体q34上的原癌基因c-ABL的片段易位至22号染色体q11上的断裂点簇集区（breakpointclusterregion，BCR），产生BCR-ABL融合基因。这也是人类在白血病染色体易位中发现的第一个融合基因。2021/4/274CytogeneticAbnormalityofCML:

ThePhChromosome9222021/4/2752021/4/276

Bcr/abl融合基因的结构2021/4/277Bcr/abl融合蛋白与白血病1.p210BCR-ABL,见于绝大部分CML及50%以上成人Ph染色体阳性的ALL。2.p190BCR-ABL,常见于50%Ph染色体阳性的成人ALL和80%Ph染色体阳性的儿童ALL。3.p230BCR-ABL,whichisassociatedwithrarecasesofPh-positiveCML.2021/4/278Bcr-abl融合基因致病的分子机制Bcr/abl融合基因的编码产物p210、p230等融合蛋白具有很强的酪氨酸蛋白激酶活性，可激活结构性酪氨酸激酶（tyrosinekinase,TK）。而酪氨酸激酶是一种催化ATPγ-磷酸酶转移到蛋白质酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白酪氨酸残基磷酸化，进而激活细胞中多种信号转到途径，促进细胞增殖，减少细胞凋亡，最终导致慢性粒细胞白血病的发生。2021/4/279三、BCR-ABL融合基因的分子生物学检测技术1.RT-PCR：是以mRNA为模板反转录出cDNA，再以cDNA为模板进行PCR，是在RNA水平上检测BCR-ABL融合基因。该方法灵敏度高，可用于MRD的检测，但反转录-PCR是一种定性实验，不能对白血病患者的BCR-ABL融合基因给出定量分析，也可能会因RNA降解而出现假阴性。2021/4/27102.实时定量荧光-PCR：是以荧光共振能量转移原理为基础，在PCR扩增的同时，加入引物的同时加入特异性的荧光探针;是通过实验检测过程中的荧光强度变化对PCR扩增产物进行的一种定量检测方法。实时定量荧光PCR由于其具灵敏度高(10－5～10－6)、可准确定量观察、迅速、重复性好等优点，在MRD检测中具有非常重要的优势。2021/4/27113.CBA法：是指用已知大小及性质的磁珠与一组可溶的蛋白分析物结合，以检测人类血液样本的BCR-ABL融合蛋白。其检测试剂为一种结合藻红蛋白(phycoerythrin，PE)的单克隆抗体，可对BCR-ABL蛋白的ABL特异性结合，当免疫磁珠与BCR-ABL融合蛋白共混时，则可形成三明治状的复合物，蛋白的BCR端为结合了抗体的微球，ABL端为结合了藻红蛋白的抗体。基于抗体的大小及性质，可使用流式细胞仪对该种复合物进行研究，从而检测出BCR-ABL融合蛋白。2021/4/2712BCR-ABL融合基因可翻译产生融合蛋白可以被抗BCR的捕获磁珠及连接PE的抗ABL抗体结合。在流式细胞仪上对捕获磁珠的检测，可检测出PE的荧光信号。2021/4/27134.FISH法：是利用标记的DNA或RNA探针直接在染色体、细胞或组织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行定量。主要应用于染色体易位形成的融合基因检测、基因缺失的检测及MRD检测等。具有快速、安全、经济、灵敏度高、特异性强等优点。对白血病临床疗效的判定及预测预后也具有重要意义。2021/4/27145.Southern印迹(SouthernBlot)法可对bcr-abl融合基因DNA重排进行分子生物学检测。将待测基因组DNA片段经电泳分离后转移到固相杂交膜上，用取自M-bcr3’和5’端的bcr探针与之杂交，经放射自显影洗片后即可显示所要检测的条带，对于CML患者，除可见到一条与胚系bcr基因组DNA相对应的条带外，其他的条带说明存在重排的bcr等位基因。2021/4/2715Southen印记法实验流程图2021/4/2716四、分子靶向治疗（moleculartargetingtreatment）信号传导抑制剂

(SignalTransductionInhibitor,STI)2021/4/2717分子靶向药物——酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼（imatinibmesylate），商品名为格列卫，为治疗CML的常用分子靶向药物。属小分子化合物，是一种特异性很强的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）。对体内众多酪氨酸激酶，它仅能抑制BCR-ABL融合基因产物P210和P190、PDGFR（血小板衍化生长因子）与c-Kit受体的酪氨酸激酶。2021/4/2718格列卫药理作用的分子机制格列卫通过特异性地与BCR/ABL激酶结构域的ATP位点结合，抑制其酪氨酸激酶活性,使酪氨酸残基不能磷酸化，从而抑制其细胞信号传导途径,促使细胞凋亡和抑制Ph阳性白血病细胞的增殖。格列卫是CML治疗史上的里程牌,并且对CML具有很好的疗效，可使患者达到遗传学或分子生物学缓解。2021/4/2719Mechanismofactionofimatinib.ByoccupyingtheATPbindingpocketoftheABLkinasedomain,imatinibpreventssubstratephosphorylationanddownstreamactivationofsignals,