中药饲料添加剂调控仔猪肠道微生态平衡研究进展

中药饲料添加剂调控仔猪肠道微生态平衡研究进展孔祥峰，印遇龙中国科学院亚热带农业生态研究所畜禽健康养殖研究中心2010.10.17报告提纲

中药饲料添加剂介绍肠道菌群的功能肠道菌群发育规律中草药功效与肠道菌群肠道菌群的中草药饲料添加剂调控中药饲料添加剂介绍概念：中药饲料添加剂，顾名思义就是以中药为原料制成的饲料添加剂。分类：从营养角度可将饲料添加剂分为营养性和非营养性饲料添加剂两大类。由于中药含有多种有效成分，兼有营养和药用功能，基本具备饲料添加剂的所有作用，可作为一类独立的饲料添加剂。特性：中药多为复杂的有机物，其组成成分均在数十种，甚至达到上百种，按照“构效关系”理论（即一种成分可产生一种作用）来说，中药具有“多能性”。中药饲料添加剂的分类

鉴于中药饲料添加剂的特殊性，目前尚无统一的分类标准。一般按照药材来源、原料类型、产品作用、组方和剂型进行分类。按药材来源：分为植物类（山楂、黄芪等）、动物类（鸡内金、地龙等）、矿物类（麦饭石等）和化合物类。按原料类型：分为原产物、加工提取物（刺五加提取物、黄芪多糖等）和副产物（党参茎叶、人参渣、沙棘果渣等）。按照剂型：分为常规散剂、复方提取物粉剂和颗粒剂、超微粉等剂型。目前常用的中药饲料添加剂是常规散剂。中药饲料添加剂的分类按照组方：分为单味中药提取物、单味中药、复方中药和中西药结合饲料添加剂。目前一般使用的是复方中药添加剂，即在中兽医理论指导下，依据君臣佐使的法则遣方用药，以发挥其群药的综合作用。按产品作用：分为防病保健(增强免疫、抗菌驱虫、健胃消食、养血滋阴、清热解毒、安神行气)、增加生产性能(主要用于促生长、促生殖、提高肉、蛋、奶及经济动物产品产量)、提高产品质量(如用姜黄素改善鸡蛋品质，用红辣椒、万寿菊等改善肉鸡的肉品质)和改善饲料品质(如用大蒜素刺激动物食欲、延长饲料贮存期)等四类。

生物拮抗免疫功能营养功能胃肠道菌群有益作用维生素的合成与代谢蛋白质合成与氮代谢多糖和粗纤维分解代谢脂类的分解代谢胃肠道菌群的功能胃肠道菌群的有害作用BECDA增加免疫成本竞争营养物质产生有害氨基酸代谢物改变肠道的结构与功能降低脂肪的消化率胃肠道菌群的功能实验动物：1、7、14、21和28日龄的哺乳仔猪各6头。样品采集：取空肠、回肠、盲肠和结肠内容物，提细菌DNA。试验方法与测定指标：PCR-DGGE技术比较肠道菌群的结构和多样性，Real-timePCR方法定量肠道优势菌群。哺乳仔猪肠道菌群发育规律研究细菌引物序列产物大小乳酸杆菌Lab-0159Univ-05155’-AAGATGCAGCTCTTGTGTTG-3’5’-ATCGTATTACCGCGGCTGCTGGCA-3’356bp双歧杆菌Bif-xfp-2294-fBif-xfp-2691-r5’-ACCAAGGTCAACCTCCTCTCTG-3’5’-TGCCCAGATTCAGCAAAGTCC-3’397bp肠杆菌F-entR-ent5’-ATGGCTGTCGTCAGCTCGT-3’5’-CCTACTTCTTTTGCAACCCACTC-3’300bp链球菌16S-19516S-4895’-CAGTATTTACCGCATGGTAGATAT-3’5’-GTAAGATACCGTCAAGTGAGAA-3’294bp试验结果随日龄增加，肠道菌群结构变得复杂多样，且肠道后段菌群多样性高于肠道前段；每一仔猪个体都有自己独特的肠道微生物组成，日龄越小，不同个体间菌群差异越小。盲肠微生物DGGE图谱结肠微生物DGGE图谱回肠微生物DGGE图谱试验结果1～7日龄仔猪胃肠道内乳酸菌、链球菌和肠杆菌占细菌总数的比例较高，出生1周后乳酸杆菌丰度降低，双歧杆菌等厌氧菌开始成为肠道优势菌，14天后空肠和回肠链球菌丰度增加。

运用基于16SrDNA克隆文库技术构建了3个克隆文库并测序分析，共得到536条非嵌合的16SrDNA全长序列。根据99%的序列相似性划分为157个进化型，其中主要的优势菌群在系统发育地位上基本属于乳酸杆菌属、链球菌属、罗氏菌属、梭菌属和葡萄球菌属。其中21和28日龄哺乳仔猪以及21日龄断奶后1周仔猪分别测序了171、194和171个克隆，各自划分为40、61和56个OTUs。

哺乳和断奶仔猪回肠微生物发育树哺乳仔猪断奶仔猪断奶对仔猪胃肠道菌群发育规律的影响

发现断奶应激使仔猪肠道链球菌属增加23%，乳酸杆菌属降低36%，肠道菌群失调是引起腹泻的主要原因。88%52%3.5%26.3%断奶对仔猪回肠优势微生物的影响断奶对仔猪胃肠道菌群发育规律的影响中草药功效与胃肠道菌群中医用药的特色之一就是以汤剂的形式口服用药。汤剂在发挥药效作用前，除了在炮制、煎煮过程中会产生动态变化外，进入机体后亦要发生一系列的动态变化。这种变化的第一个过程就是在消化道内被消化液和肠内细菌生物转化和/代谢。药物在消化道内的行为包括：调节肠内微生态，引发生物活性物质如双歧因子分泌，产生生物效应；破坏肠内微生态平衡而促进新的平衡系统建立。由此可见，肠内细菌对中药成分结构的生物转化和/代谢在中药药效上起着重要的作用。中草药功效与胃肠道菌群利用中药成分的肠内细菌生物转化和/代谢模型体外研究中药成分在肠内是如何被细菌转化和代谢的，更接近于真实情况，对揭示中药作用机制具有十分重要的意义。“十一五”国家科技支撑计划重点项目“中兽药现代化技术研究与开发”的部分内容：依据生物体内药物代谢转化机理，利用益生菌和发酵技术，提高中药有效部分的生物活性，增加其产量；利用中药与益生菌间的相互作用，提高菌、药生物学效应，改善其生物利用度。胃肠道菌群的中草药饲料添加剂调控实验动物和分组：60头21日龄断奶仔猪，随机分为3组，每组20重复。处理1添加0.1%刺五加提取物，处理2添加0.02％粘杆菌素，处理3为基础日粮。样品采集：分别于试验开始后第7、14和28d从各处理随机选取5头试猪，处死后取空肠、回肠、盲肠和结肠内容物，提取细菌DNA。试验方法与测定指标：体外培养菌落计数法计数大肠杆菌和乳酸杆菌的数量，PCR-DGGE技术比较肠道菌群的结构和多样性。试验结果细菌计数结果表明，21日龄断奶仔猪日粮中添加刺五加提取物，可显著抑制肠道中大肠杆菌增殖，促进乳酸杆菌生长，有益于断奶仔猪的肠道健康。大肠杆菌空肠5.335±0.176c5.735±0.114b5.971±0.146a回肠5.791±0.052c6.168±0.104b6.431±0.099a盲肠5.778±0.048b6.173±0.062a6.105±0.098a乳酸杆菌空肠7.286±0.124a6.996±0.096b6.835±0.474b回肠7.859±0.105a7.574±0.072b7.520±0.084b盲肠7.661±0.077a7.698±0.096a7.547±0.088b刺五加提取物对断奶仔猪肠道内容物细菌数量的影响(LgCFU/g,n=5)abb腹泻率(%)刺五加提取物对腹泻率的影响试验结果添加后第7、14和28d时，提取物组盲肠内容物细菌种类较对照组多，第28d时空肠内容物细菌种类比对照组多；3个处理间各肠段内容物细菌种类的相似性均达56.9%以上。提示刺五加提取物能显著增加肠道微生物的多样性，这是其防治断奶仔猪腹泻、促进生长的机理之一。添加后第7d添加后第14d添加后第28d山药多糖对微生物发酵的调控作用研究目的：评价分段醇沉得到的4个山药多糖的体外发酵特性及其对肠道微生态的影响，探讨其用做饲料添加剂的可行性。采用体外发酵技术评价4个山药多糖对盲肠食糜的体外发酵特性和发酵产物的影响；利用PCR-DGGE技术比较肠道菌群的结构和多样性。实验动物及分组：40只SD大鼠随机分为4组，单笼饲养。对照组饲喂基础日粮。处理组(II组、III组和IV组)分别在基础日粮中添加0.25、0.5和1.0g/kg60%醇沉山药多糖。处死后取空肠、回肠、盲肠和结肠内容物，提取细菌DNA，测定肠道微生物和挥发酸的变化。试验结果处理pH值NH3（mg/dl）30%醇沉多糖组6.72±0.13B20.00±0.42B45%醇沉多糖组5.83±0.12D6.55±0.76C60%醇沉多糖组5.78±0.22D3.97±0.24D75%醇沉多糖组6.17±0.11C3.83±0.37D葡萄糖对照组5.49±0.15D3.89±0.38D培养液对照组7.62±0.06A26.82±0.48A山药多糖体外发酵模式图发酵液的pH值和NH3含量（n＝4）75%醇沉多糖发酵动力学参数最优，并显著优于葡萄糖；45％、60％醇沉多糖和葡萄糖组pH值最低，60％、75％醇沉多糖和葡萄糖组NH3含量最低。提示60%和75%醇沉山药多糖是2种理想的可被猪盲肠微生物利用的碳源，并可改变微生物产生的SCFA含量与组成。试验结果60%和75%醇沉山药多糖是2种理想的可被盲肠微生物利用的碳源，并可改变盲肠微生态区系及产生的短链脂肪酸含量与组成。60%醇沉多糖发酵动力学参数最优60%和75%醇沉多糖组盲肠微生态具有很高的相似性，且特定菌种含量显著提高，微生物种类减少1MARK2葡萄糖组3对照组475%多糖组560%多糖组645%多糖组730%多糖组盲肠微生物DGGE电泳图谱试验结果时间处理乙酸丙酸丁酸pH值第1周对照组3.8±0.24B5.2±0.26B2.4±0.24B7.1±0.48AB0.25g/kg多糖组5.5±0.37A6.4±0.66A2.9±0.28A6.6±0.48B0.5g/kg多糖组5.2±0.26A5.4±0.35B2.9±0.31A6.5±0.26B1g/kg多糖组4.0±0.47B5.0±0.85B2.3±0.30B7.4±0.20A第3周对照组4.6±0.24C6.1±0.373.2±0.26A7.0±0.110.25g/kg多糖组5.8±0.34A6.8±0.753.5±0.62A7.2±0.140.5g/kg多糖组5.3±0.22B6.6±0.383.0±0.22AB7.6±0.331g/kg多糖组4.6±0.30C6.1±0.192.6±0.21B7.5±0.35盲肠短链脂肪酸含量(μmol/g；n＝4)

试验第1周0.25和0.5g/kg多糖组盲肠食糜乙酸和丁酸含量显著高于对照组和1.0g/kg多糖组，0.25g/kg多糖组丙酸含量显著高于其它组。试验第3周0.25g/kg多糖组乙酸含量显著高于其它组。试验结果0.25g/kg的60%醇沉山药多糖可被盲肠微生物利用，改变盲肠微生态区系及其产生的短链脂肪酸含量与组成。第1周盲肠微生物DGGE电泳图谱

第3周盲肠微生物DGGE电泳图谱

从左到右依次Mark(1，微生物DNA标准条带)、对照组(2～4)、0.25g/kg添加组(5～7)、0.5g/kg添加组(8～10)、1g/kg添加组(11～13)唾液乳酸杆菌枯草芽孢杆菌多糖组唾液乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌含量高于对照组，且随试验期延长，各多糖组优势菌群数量增加，处理间各重复相似性提高。结束语中药饲料添加剂具有毒副作用小、不易产生抗药性等特点，长期合理使用可避免药物残留问题，是一种绿色饲料添加剂，具有广阔的应用前景。中药是我国传统文化遗产的一颗明珠，要创立具有中国特色的民族饲料工业，发展中药饲料添加剂是必由之路。在面临良好机遇的同时，又面临一系列严峻挑战和激烈竞争，中药的质量与安全等问题也十分突出。因此，依靠现代科学技术和创新手段，研究开发出功能确切、营养平衡、安全可靠、质量