免疫磁珠分离技术及其应用

免疫磁珠分离技术及其应用前言免疫磁珠分离技术介绍免疫磁分离技术的应用一、前言免疫磁珠分离技术(Immunomagneticbeadssep—arationtechniques，IMB)是将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的免疫学技术；是一种特异性强、灵质纯化敏度高的免疫学检测方法和抗原纯化手段。是近年来国内外研究较多的一种新的免疫学技术。目前该项技术在细胞分离、蛋白、免疫学及微生物学检测等方面均取得了较大的进展，是目前最有推广价值的技术之一。二、免疫磁珠分离技术1、免疫磁珠分离技术原理利用人工合成的内含铁成分，可被磁铁磁力所吸引，外有功能基团，可结合活性蛋白质(抗体)的磁珠，作为抗体的载体。当磁珠上的抗体与相应的微生物或特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物具有较高的磁响应性，在磁铁磁力的作用下定向移动，使复合物与其他物质分离，而达到分离、浓缩、纯化微生物或特异性抗原物质的目的。2、免疫磁珠法分类⑴、阳性分离法磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞⑵、阴性分离法磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞

一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用的更多。3、磁性微珠(magneticbeads):磁性微珠是以金属离子为核心，外层均匀包裹高分子聚合体的固相颗粒。磁性微珠上既可标记针对某种细胞表面抗原的特异性抗体（直接法）;也可标记羊抗鼠IgG抗体(间接法），使分离细胞的范围大大扩大4、免疫磁性微球的制备磁性微载体的制备：

包埋法：将磁性粒子分散于高分子溶液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段得到磁性高分子微球。

单体聚合法：在磁性粒子和单体存在下，加入引发剂、稳定剂等聚合而成的核/壳式磁性高分子微球。基本技术路线：制成磁性材料的微球，再在微球表面引入活性基团，通过载体表面偶联反应可将抗体结合到载体上，形成免疫磁性微球。优质微载体的性能：合适且均一的磁响应强度,

较小且均一的粒径,

稳定均一、特异吸附的表面性能。抗体与磁性载体的结合：磁性微载体表面的高分子层活化后悬于抗体溶液中，在室温或低温(冰水浴)下摇动一段时间即可将抗体连接到微球表面上，得到免疫磁性微球。5、该技术的主要优点⑴、细小而均一的微球为配基与受体的反应提供了较大的接触面积⑵、磁珠的磁性使其可以用磁力收集器方便快速地获得分离，且对被分离物无损伤⑶、检测复杂的生物样本和食品样本等时受到颗粒性杂质等的影响较小⑷、作为一种流动性的固相支持物，其洗涤和反应都进行得更加充分三、免疫磁性微球的应用1、用于细胞分离和提纯使用IMB进行分离细胞有两种方式；直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法，称为阳性分离；用免疫磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化的方法称为阴性分离。免疫磁珠技术可用来分离人类各种细胞如红细胞、外周血嗜酸/碱性粒细胞，神经干细胞、造血细胞、T淋巴细胞、γδT淋巴细胞，人类关节滑膜细胞，树突状细胞，内皮细胞、及多种肿瘤细胞等。2、体外细胞扩增树突状细胞(Dendriticcells，DC)、造血干、祖细胞等细胞在科研及临床上都具有巨大的应用价值，但是在体内含量较少而且分布广泛，难以获得大量高纯度的细胞，限制了该领域的发展。体外扩增辅以免疫磁珠技术有望解决这一难题。在这一过程中，用免疫磁性微球分离纯化出待扩增的细胞，用特定的因子组合培养，许多研究者用这样的方法寻找扩增的最佳细胞因子组合和移植的最佳时机。3、免疫检测免疫磁性微球可以简单快速地从血液或者骨髓中富集、清除癌细胞，广泛地应用于疾病检测、癌症治疗和自身骨髓移植中，还被用于从母体外周血中分离胎儿细胞进行无创性产前诊断。免疫磁珠分离技术用在微生物检测方面能准确快速地检测出样品中的ColiO157，这对于食品卫生和预防疾病的传播具有重要的意义。PCR技术与免疫磁珠技术结合在分子生物学、医学诊断学等方面有非常重要的作用，这方面的研究在医学检测方面的应用，可以简便快速地诊断膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、腹膜胃癌、上皮肿瘤细胞等，使免疫磁性分离技术的应用更加广泛。4、在核酸与基因工程上的应用免疫磁球可以看作是亲合层析技术中的微型配基裁体，借助亲合素-生物素（Biotin-Avidin）系统免疫磁球可与非蛋白质结合，生物素和亲合素间有着高度的亲和力，两者的结合迅速、专一、稳定，在分子生物学、医学、免疫组织化学等领域中的应用也越来越广泛，与生物磁珠技术结合后，更是产生了诱人的发展前景，并广泛地应用于分离纯化RNA、mRNA、核酸片段等及相关研究。5、用于分型免疫磁珠法可被应用于临床器官移植供受者的快速选配。在高梯度磁场下,用免疫磁珠法分离静脉或腹腔血中T、B淋巴细胞，并利用分离的淋巴细胞进行HLA-ⅠⅡ类抗原分型。如采用磁珠技术和单抗试剂建立起可在1.5h完成HLA-ⅠⅡ类抗原一类分型的新方法，还可应用免疫磁珠分离技术进行肾移植供受体的HLA分型、探讨血液病患者反复血小板输注的治疗效果与HLA之间的相关性。6、

用作靶向释药系统的载体免疫磁性微球作为靶向释药系统的载体可使免疫磁性微球上的抗癌药物更易与癌细胞接触，服用这种制剂后，在体外适当部位用一适宜强度的磁铁，将磁性微球引导到体内特定靶区，提高了杀伤癌细胞的效果。很多研究者使用不同的方法制成了针对不同癌细胞的免疫磁性微球，作为靶向释药系统的载体并在实验中证实这种释药载体具有良好的功效。斑点免疫层析、免疫磁分离技术在E．coli0157：H7检测中的应用1、E．coli0157：H7

是大肠杆菌的其中一个类型，该种病菌常见于牛羊等温血动物的肠内。这一型的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，并可能导致肠管出现严重症状。已被世界卫生组织确定为新发现的28种传染病病原体之一,成为各国食品安全和公共卫生监控的重点。

⑴病征：患者可能出现各种症状，包括严重的腹泻、带血腹泻、发烧、腹绞痛及呕吐。情况严重时，更可能并发急性肾病。5岁以下的儿童出现该等并发症的风险较高。若治疗不当，可能会致命。

⑵传播途径：该种疾病可通过饮用受污染的水或进食未熟透的食物(特别是免治牛肉、汉堡扒及烤牛肉)而感染。饮用或进食未经消毒的奶类、芝士、蔬菜、果汁及乳酪而染病的个案亦有发现。此外，若个人卫生欠佳，亦可能会通过人传人的途径，或经进食受粪便污染的食物而感染该种病菌。

⑶潜伏期：通常为3至4日，但亦会长达9日。

⑷治理方法：感染大肠杆菌O157:H7的临床治理方法主要属支持性治疗。若患者出现腹泻，补充失去的水份及电解质十分重要。约50%有肾并发症的患者在出现急性症状时需要特别治疗或输血。2、斑点免疫层析法（DICA)又称免疫胶体金标记法．是利用免疫色层技术来检测样品中E.ColiO157在E．Coli检测卡上，将胶体金标记的兔抗O157，抗体和兔抗羊IgG抗体分别固定在膜上下，做为测试带和质控带。样品增菌液滴加到加样孔膜上并展开．若含有E.ColiO157就会结合到检测带处形成抗原—抗体复合物而星现可见的红色带，而羊IgG结台到质控带星现红色，它具有简便、快速定性作用。3、检验方法⑴mEC增菌培养取样品5g接种到50ml10％新生霉索mEC增菌液中摇匀放恒温摇床，37℃振荡培养6h。⑵DICA法用试剂盒所配专用棉拭子，沾取样品增菌液后，插入EHE．Coli检测卡一端的加样孔中，10min内读取结果；只有质控带出现红色条带表明无E．ColiO157抗原存在．同时也表示实验正确；出现两条红色条带(测试和质控带)表示可能有E．ColiO157抗原存在,如均无出现红色条带，表示实验失败。

⑶IMS法将样品增菌液分成DICA法阳性和阴性两组．均取1ml加入1.5mlep离心管中(离心管事先已加入20μl免疫磁珠)振摇20～30min，上磁铁板吸附沉淀免疫磁珠，吸去上清液，反复用PBT-T洗涤2次，加50μlPBs-T重悬浮、混匀，分涂于2块CT-SMAC平板37℃培