微生物的生长和环境条件

微生物的生长

与环境条件第七章一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用>异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。生长与繁殖的概念个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）

个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖第一节纯培养微生物群体的生长第二节微生物个体的生长和分化第三节影响微生物生长的主要因素纯培养(pureculture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。第一节测定微生物生长繁殖的方法稀释平皿法划线法单细胞挑取法纯培养方法稀释平板法平皿划线分离法获得纯培养的方法单细胞挑取法：从待分离材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养的过程。获得纯培养的方法细菌群体生长的测定细胞数量的测定细胞总数测定

活细菌数量的测定细胞生物量的测定（一）细胞数量的测定细胞总数测定直接法(干重法，测体积法)间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）活细菌数量的测定直接法（死、活细胞总数）血球计数板、比例计数法间接法（活菌）平板菌落计数法、液体稀释法、膜过滤法1、显微镜直接计数法使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。

优点：操作简便，计数直观。（一）细胞数量的测定2、比浊计数法根据细菌悬浮液的吸光度测定其数量。

优点：简便，直接。（一）细胞数量的测定3、稀释平板计数法对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。

优点：传统计数方法。对设备要求不高。10-310-510-410-6（一）细胞数量的测定（二）微生物生长量的测定

直接法

1、测体积法

2、称重法间接法

1、含氮量测定法

2、DNA含量测定法

3、其他生理指标法（1）粗放的测体积法（2）精确的称干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来，然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%～20%，而一个细菌细胞一般重约10-12～10-13g。该法适合菌浓较高的样品。例：大肠杆菌一个细胞一般重约10–12~10–13g，100ml培养物若得10~90mg干重的细胞。则液体培养物中细胞浓度达到2×109个/ml

。1直接法测含氮量

蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量:

N×6.25=Pr其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产CO2、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。2、间接法第二节微生物的生长规律一、单细胞微生物的典型生长曲线二、微生物的同步生长三、微生物的连续培养

一、单细胞微生物的典型生长曲线

【分批培养】将一定量的微生物接种在一个封闭的、盛有一定量液体培养基的容器内，保持一定的温度、pH和溶解氧量，微生物在其中生长繁殖；结果会出现微生物数量由少变多，达到高峰后又由多变少，甚至死亡的变化规律。

【生长曲线】

：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线。

一、单细胞微生物的典型生长曲线

单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的。

由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（Ｇenerationtime,G），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间，有时也称为倍增时间。生长速率常数：每小时分裂次数，用R表示。

右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。如图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。即：X2=X1•2n将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。生长曲线的制作接种 适温培养定时取样测定生长量☆以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。☆生长曲线代表了单细胞微生物在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。☆每种单细胞微生物都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。总菌数活菌数培养时间/h

Ⅱ.对数期Ⅲ.稳定期Ⅳ.衰亡期Ⅰ.延滞期细菌数目（个/ml）对数ⅡⅢⅣⅠ根据微生物的生长速率常数的不同，可将生长曲线大致分为四个时期：又称：停滞期、调整期、适应期1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。2.特点：生长速率常数R=0细胞形态变大或增长合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物（一）延缓期（lagphase）认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期，措施有：①接种龄：采用对数生长期的健壮菌种；②增加接种量；一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）；

③调整培养基的成分，应适当丰富，且发酵培养基成分尽量与种子培养基的成分接近。

（二）对数期（logarithmicphase）在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数目以几何级数增长的时期。其对数与时间呈直线关系。

1、对数期的特点：

生长速率常数R最大，即代时最短;

细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致;

酶系活跃，代谢最旺盛;

细胞对理化因素较敏感。2、对数期中的的三个重要参数繁殖代数（n）

指数生长方式：1、2、4、8……2n

设接种时细胞数为x1,时间为t1,到时间t2后，繁殖n代，细胞数为x2，它们之间的相互关系为：

x2=x1·2n以对数表示：㏒x2=㏒x1+n㏒2∴n==3.322(㏒x2-㏒x1)

㏒x2-㏒x1㏒2x2x1t2t1培养时间Lg

细胞数/mlt2-t13.322(lgx2-lgx1)生长速率常数R=t2-t13.322(lgx2-lgx1)代时G=

繁殖代数n=3.322(lgx2-lgx1)影响对数期微生物代时长短的因素菌种营养成分营养物浓度培养温度生长限制因子:凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物。一些细菌的代时菌名 培养基 培养温度 代时E.coli（大肠杆菌） 肉汤 37℃ 17minE.coli 牛奶 37 12.5 Enterobacter

aerogenes（产气肠细菌） 肉汤或牛奶37 16~18 E.aerogenes

组合 37 29~44B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 18B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 18.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 66~87Streptococcuslactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 26S.lactis

乳糖肉汤 37 48Azotobacter

chroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 792~93 Nitrobacter

agilis（活跃硝化杆菌） 组合 27 1200应用意义：对数期的微生物具有整个群体的生理特性一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点，是：（1）用作代谢、生理等研究的良好材料；（2）是增殖噬菌体的最适宿主；（3）是发酵工业中用种子的最佳材料。（4）进行染色、形态观察等的良好材料。（三）稳定期（stationaryphase，恒定期、最高生长期）1．特点：（1）R=0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。培养物中的细胞数目达到最高值。（2）菌体产量达到了最高点；（3）菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系（4）细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；（5）芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢；（6）通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢物（稳定期产物）。2．稳定期到来的原因（1）营养物尤其是生长限制因子耗尽；（2）营养物的比例失调；（3）酸、醇、毒素等有害代谢产物的累积；（4）pH、氧化还原势等物理化学条件越来越不适宜；等等.（四）衰亡期（declinephase）1、特点：（1）细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”（

R＜0）

；（2）细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形；（3）有些菌体因蛋白水解酶活力的增强而发生菌体自溶；（4）有的微生物合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢（5）芽孢杆菌在此期释放芽孢；等等。2、产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡。由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难（用电子显微镜和同步培养技术）。同步生长（synchronousgrowth）：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长。同步细胞：进行同步分裂的细胞称为同步细胞。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。二、微生物的同步生长获得同步生长的方法：获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：抗生素、变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。机械筛选法：选择性过滤、梯度离心或膜洗脱法。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。硝酸纤维素膜法原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于具不同电荷的硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。

★这种细胞在培养过程中，一般经2–3个分裂周期就会丧失其同步性。

三、微生物的连续培养（continuousculture）连续培养（continuousculture）：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。概念：根据培养器内微生物的生长密度，借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体高密度、生长速度恒定的微生物细胞。原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌液浓度不变,即浊度不变。当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。恒浊培养使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。第三节环境条件对微生物生长的影响影响微生物生长的外界因素很多，除了营养因素之外，还有许多物理化学因素，如：O2、温度、pH值、水活度、渗透压、Eh、辐射、UV、电离辐射、超声波、化学药剂等

。一、温度二、水分和渗透压三、pH值四、氧和氧化还原电位五、辐射六、化学杀菌剂和抑菌剂第三节环境条件对微生物生长的影响温度是影响微生物生长繁殖的最重要因素之一。温度对微生物的影响具体表现在直接影响细胞内的各种生化反应：影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。影响物质的溶解度，对生长有影响。一、温度对微生物生长的影响从微生物整体来看:生长的温度范围一般在-10℃~100℃极端下限为-30℃，极端上限为105~300℃但对于特定的某一种微生物：只能在一定温度范围内生长（宽温微生物、窄温微生物）。在这个范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度。最适生长温度：某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。（一）微生物生长温度的三基点根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型：（二）微生物生长温度类型低温型微生物（嗜冷微生物）：＜20℃

（一般为15℃

）。

中温型微生物（嗜温微生物）：20～45℃

，室温菌约25℃

，体温菌约37℃

。高温型微生物（嗜热微生物）：＞45℃

，一般50～60℃

。

低温型微生物：最适生长温度在5~20℃,主要分布在地球的两极、冷泉、深海、冷冻场所及冷藏食品中。中温型微生物：最适生长温度为25℃~40℃，大多数微生物属于此类。室温型主要为腐生或植物寄生，在植物或土壤中。体温型主要为寄生，在人和动物体内。高温型微生物：最适生长温度为45℃~60℃,主要分布在温泉、堆肥和土壤中。1、高温对微生物的影响高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。微生物对热的耐受力与以下因素有关:（1）微生物种类及发育阶段嗜热菌比其它类型的菌体抗热有芽孢的细菌比无芽孢的菌抗热微生物的繁殖结构比营养结构抗热性强老龄菌比幼龄菌抗热（三）高温与低温对微生物的影响（2）微生物对热的耐受力还受环境条件的影响与培养基的营养成分有关——培养基中蛋白质含量高时比较耐热.与pH有关——pH适宜时不易死亡，pH不适宜时，容易死亡.与水分有关——含水量大时容易死亡，含水量小时不容易死亡.与含菌量有关——含菌量高，抗热性增强，含菌量低，抗热性差。与热处理时间有关——热处理时间长，微生物易死亡。

当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的生长繁殖停止，当微生物的原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4℃的冰箱中。当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡，有些则并不死亡。2、低温对微生物的影响造成死亡的原因：①冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏。②冻结过程造成细胞脱水。冻结速度对冰晶形成有很大影响，缓慢冻结，形成的冰晶大，对细胞损伤大；快速冻结，形成的冰晶小、分布均匀，对细胞的损伤小，因此，利用快速冻结可以对一些菌种进行冻结保藏，一般情况下在菌悬液中再加一些甘油、糖、牛奶、保护剂等可对菌种进行长期保藏。二、水分对微生物生长的影响细菌最适水的活度值：0.93-0.99

酵母菌最适水的活度值：0.88-0.91

霉菌最适水的活度值：

0.80

应用：干燥法保存物品食品的冷冻干燥水的活度小于0.60-0.70时休眠、部分出现细胞脱水、蛋白质变性(多数微生物)◆影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。◆改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.5～5产乙醇，在pH6.5以上产甘油、酸。◆环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。三、pH值对微生物生长影响（一）环境pH值对微生物生长的影响微生物的生长pH值范围极广，从pH<2~>10都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.0~9.0之间。微生物生长的pH值三基点：各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。（二)不同微生物对pH要求不同不同的微生物最适生长的pH值不同。

根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为：嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌耐碱微生物：许多链霉菌中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌嗜酸微生物：硫杆菌属耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌

微生物名称

pH值 最低最适最高Thiobacillus

thiooxidans

氧化硫硫杆菌

0.5 2.0~3.5 6.0Lactobacillusacidophilus嗜酸乳杆菌

4.0~4.65.8~6.6 6.8Rhizobium

japonicum

大豆根瘤菌

4.2 6.8~7.0 11.0Azotobacter

chroococcum

圆褐固氮

4.5 7.4~7.6 9.0Nitrosomonassp.硝化单胞菌

7.0 7.8~8.6 9.4Acetobacter

aceti

醋化醋杆菌

4.0~4.55.4~6.3 7.0~8.0Staphylococcusaureus

金黄葡球菌

4.27.0~7.5 9.3Chlorobium

limicola

泥生绿菌

6.0 6.8 7.0Thurmus

aquaticus

水生栖热菌

6.07.5~7.8 9.5Aspergillus

niger

黑曲霉

1.55.0~6.0 9.0一般放线菌 5.0 7.0~8.0 10.0一般酵母菌 3.05.0~6.08.0不同微生物的生长pH值范围微生物种类最低pH最适pH最高pH大肠杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌黑曲霉一般放线菌一般酵母菌

1.55.03.06.0—8.06.0—7.57.0—7.55.0—6.07.0—8.05.0—6.09.0108.0

一些常见微生物生长的pH值范围同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH值要求不同。例如：丙酮丁醇梭菌

在pH值=5.5—7.0时，以菌体生长为主在pH值=4.3—5.3时，进行丙酮丁醇发酵同一种微生物由于环境pH值不同，可能积累不同的代谢产物。例如：黑曲霉pH值=2～3时，产物以柠檬酸为主，只产少量草酸。pH值在7左右时，产物以草酸为主，只产少量柠檬酸。

几种抗生素产生菌的生长与发酵的最适pH

微生物 生长最适pH 合成抗生素最适pH

灰色链霉菌 6.3~6.9 6.7~7.3

红霉素链霉菌 6.6~7.0 6.8~7.3

产黄青霉 6.5~7.2 6.2~6.8

金霉素链霉菌 6.1~6.6 5.9~6.3

龟裂链霉菌 6.0~6.6 5.8~6.1

灰黄青霉 6.4~7.0 6.2~6.5（三）微生物细胞内的pH值虽然微生物生活的环境pH值范围较宽，但是其细胞内的pH值却相当稳定，一般都接近中性。这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和细胞内酶所需要的最适pH值。微生物胞内酶的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH值接近环境pH值。氧对微生物的生命活动有着极其重要的影响，微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:

专性好氧菌

好氧菌

微好氧菌

兼性厌氧菌

耐氧厌氧菌

厌氧菌

(专性)厌氧菌四、氧气对微生物生长的影响五类与氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态（模式图）严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物。好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等，而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。厌氧菌的氧毒害机制——SOD学说：各类菌所含对氧解毒酶专性好氧菌SOD，过氧化氢酶兼性厌氧菌SOD，过氧化氢酶专性厌氧菌二种酶均无微好氧菌