微生物耐药基础与临床之真菌耐药监测

真菌耐药监测

真菌概述临床真菌学抗真菌药物真菌耐药机制真菌耐药监测真菌Fungus一大类真核细胞型微生物。细胞核高度分化，有核膜和核仁，胞浆内有完整的细胞器。细胞壁由纤维素、几丁质或葡聚糖组成，不含肽聚糖。含叶绿素，无根、茎、叶的分化。从外界获取碳源，有性或无性繁殖，行腐生或寄生生活。真菌与动物、植物、细菌的区别真菌细胞的结构

fungalcellularstructure细胞壁cellwall：含几丁质、葡聚糖、甘露聚糖细胞膜cellmenbrane：含麦角固醇类化合物ergosterol细胞质cytoplasm:完善的细胞器，其中核糖体ribosome

80S细胞核：单细胞真菌

Single-cellfungi：多细胞真菌Multicellularfungi：两相性真菌dimorphicfungi：P99根据细胞形态和结构分类单细胞真菌

single-celledfungi酵母菌yeasts酵母菌出芽繁殖Yeastsreproducebybudding酵母菌yeasts类酵母菌yeast-likefungi假菌丝pseudohyphae

孢子sporeBudding出芽繁殖单细胞真菌

single-celledfungi多细胞真菌Multi-cellularfungi孢子spore菌丝hypha丝状菌filamentousfungus或霉菌molds菌丝的形态有助于真菌菌种鉴定厚膜孢子、关节孢子和大分生孢子的形态有助于真菌菌种鉴定二相性真菌单细胞型：酵母菌多细胞型：丝状菌机体内寄生37℃含动物蛋白培养基沙保培养基25℃普通培养基25℃真菌的检验方法镜检真菌形态真菌分离培养与鉴定：真菌抗原检测真菌核酸检测真菌代谢产物检测免疫学检测动物实验临床标本直接检查直接镜检核酸检测分离培养染色标本：革兰染色墨汁负染色法乳酸酚棉兰染色法荧光染色法菌丝型沙氏培养基病理组织标本真菌的检验程序不染色标本KOH法动物试验检测抗原检测抗体37℃观察菌落酵母型25℃小培养镜检生化反应皮肤、指（趾）甲、毛发：血液脑脊液、胸腹水、脓液等口咽、痰、泌尿生殖道标本（注意避开正常菌群的污染！！！）

浅部真菌感染：皮屑、指（趾）甲、毛发深部真菌感染：痰、血液、脑脊液、分泌物一、标本的采集二、标本的直接检查1.不染色标本的检查：观察孢子和菌丝。

取皮肤癣屑、感染的毛发、指趾甲+10%~20%KOH溶液（使角质软化）+盖玻片：镜下观察观察孢子和菌丝。

菌丝孢子2.染色标本的检查1）革兰氏染色：

真菌比细菌大，直径5µm以上。真菌革兰染色阳性，但着色不均。2）乳酸酚棉兰染色3）墨汁负染：4）荧光染色三、真菌的分离培养培养条件：低营养、低温度（浅部真菌，20~28℃，深部真菌为37℃）、低pH(4.0-6.0)、高湿度和氧培养基：

Sabouraud沙保培养基酵母型真菌菌落类酵母型真菌菌落菌落：湿润、柔软而致密，形态似一般细菌菌落丝状菌落四、真菌的鉴定形态学检测及代谢试验动物接种病理组织检查免疫学检查核酸检测真菌抗原测定真菌代谢产物检测假丝酵母菌显色培养基真菌抗原测定隐球菌抗原乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原GM试验（半乳甘露聚糖）：阳性提示曲霉感染

*半乳甘露聚糖是曲霉细胞壁的成分G试验（β-D葡聚糖）:阳性提示真菌感染*β-D葡聚糖是多种真菌细胞壁的成分G试验无特异性，不能确定种属

G试验不能检测接合菌（毛霉、根霉）和隐球菌浅部感染真菌Superficialfungi

引起皮肤表面真菌病、表皮真菌病、皮下真菌病causesuperficialmycoses，cutaneousmycoses,subcutaneousmycoses深部感染真菌Systemic（Deep）fungi

引起深部真菌病deepmycoses按感染的部位分类ClassificationBasedonSite浅部真菌感染侵犯皮肤角蛋白组织（表皮角质层、毛发，甲板），引起癣病浅部真菌分：皮肤癣菌和角层癣菌感染源：接触患者、患畜或染菌物品是指除表皮、毛发、甲床真菌感染以外侵犯内脏、皮下组织、皮肤(角质层以下)和粘膜的真菌引起的感染深部真菌感染的病原主要可分为致病性真菌－如组织胞浆菌、球孢子菌、类球孢子菌、皮炎芽生菌、着色真菌、足分支菌、孢子丝菌等，感染多呈地区性流行条件致病性真菌－如念珠菌、隐球菌、曲菌、毛霉菌、放线菌、奴卡菌等属，在防御免疫功能低下者易获感染深部真菌感染口腔白假丝酵母菌（1000×）外阴白假丝酵母菌（1000×）临床真菌感染现况随着移植、肿瘤和免疫缺陷患者的增多，侵袭性真菌感染（Invasivefungalinfections，IFI）越来越多IFI：系指真菌侵入人体组织、血液，并在其中生长繁殖引致组织损害、器官功能障碍、炎症反应的病理改变及病理生理过程。IFI的病原菌主要包括假丝酵母菌、曲霉常见的真菌病曲霉菌病假丝酵母病新生隐球菌病浅部真菌病：皮肤癣菌病真菌毒素中毒常见的抗真菌药物的作用机制及其耐药性

抗真菌药物按作用机制分类

1.作用于真菌细胞壁：

2.作用于真菌细胞膜：

3.作用于真菌核酸：4.作用于真菌蛋白质合成：5.其他：大蒜新素、冰醋酸、中草药1）作用于真菌的细胞壁：真菌细胞壁中含有甘露聚糖、几丁质、葡聚糖等主要成分作用于1，3－β－D－葡聚糖合成酶类抗真菌药物：棘白菌素类药物作用于真菌细胞壁几丁质的药物：多氧菌素D和尼可霉素Z和X研究中的作用于真菌细胞表面结构的其他抗真菌药物：棘白菌素类抗真菌药物抑制真菌细胞壁β-(1,3)-D-葡聚糖的合成而干扰细胞壁合成目前有卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净3个品种。对于念珠菌，曲霉等均有良好的抑制活性，对于一些双相真菌如组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌等也有抑制作用，但是对于新生隐球菌、镰刀菌、接合菌和白吉利毛孢子菌等无抑制活性。 不良反应较轻微，相对安全棘白菌素类药物产生耐药性的主要机制细胞壁的合成障碍:

细胞生长和形态改变过程中，细胞壁的合成和修护受到严密的调控，细胞壁在许多抗真菌药物的刺激下会产生适应性改变而耐药；在棘白菌素类药物的作用下，耐药真菌的部分受体Wsc1和Mid2会介导细胞壁出现相应的反应。2）作用于真菌的细胞膜：多烯类药物：

两性霉素B及其酯类制剂吡咯类抗真菌药：

咪唑类、三唑类烯丙胺类药物：

盐酸特比萘芬和盐酸荼替芬（1）多烯类药物（polyenes）直接和细胞膜上的麦角固醇结合，导致细胞膜的通透性增加而导致细胞死亡。主要用于深部真菌感染。 包括：两性霉素B及其三种脂化两性霉素B、制霉菌素等；两性霉素B由链霉菌产生的抗真菌药物。抗菌谱广：念珠菌、隐球菌、组织胞浆菌、酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌属等有效；部分土曲霉天然耐药；皮肤和毛发癣菌通常耐药。

作用强，耐药相对较低，是侵袭性真菌感染的标准治疗药物两性霉素B优点抗真菌谱广，疗效确切，耐药真菌少，半衰期长(24h)可一日一次用药缺点蛋白结合率高>90%血药浓度相对较低，不进入脑脊液，毒性大，不良反应多(即刻肝、肾、血液、低钾、心脏等)

给药需从小剂量递增对某些真菌效差或无作用(曲菌、毛霉菌、皮肤、毛发癣菌)两性霉素B剂型改进两性霉素B脂质体—L-AmB两性霉素B脂质复合物—ABLC两性霉素B胶体分散体—ABCD作用：抗真菌作用与两性霉素B同，肾毒性低适应症：（1）IFI的经验及确诊治疗。（2）无法耐受两性霉素的患者。（3）肾功能严重损害不能使用两性霉素B常规制剂的患者制霉菌素制霉菌素口服不易吸收，主要用于局部用药。用于皮肤、膀胱、口腔及阴道等的念珠菌感染,体内过程和抗菌作用与两性霉素B基本相同,但毒性更大且具有不溶解性。制霉菌素脂质体减少了毒性,解决了制霉菌素的溶解性问题,开发前景看好。制霉菌素脂质体具有广谱抗真菌活性,体外试验显示其可有效对抗一系列真菌菌株,如念珠菌属、镰刀菌属、曲霉菌属等，对新型隐球菌属效果明显,其中某些菌株对现有抗真菌疗法耐药。制霉菌素脂质体(Nyotran)多烯类药物产生耐药性的主要机制通过编码5，6-甾醇去饱和酶的基因发生突变，使其细胞膜中的麦角甾醇结构发生了改变，导致细胞膜的流动性改变，降低了药物对细胞膜的亲和力。对两性霉素B耐药菌的出现频率仍非常低。通过抑制真菌细胞色素P450依赖的-羊毛甾醇14α-去甲基化酶作用，导致麦角固醇合成受阻，使真菌的细胞膜合成受阻，导致真菌细胞破裂死亡。（2）咪唑类抗真菌药物吡咯类抗真菌药包括咪唑类和三唑类衍生物两大类：咪唑类:

酮康唑、克霉唑、咪康唑和益康唑等（口服吸收差，目前均作为局部用药）三唑类:

氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑

三唑类药物氟康唑

伊曲康唑伏立康唑泊沙康唑第一个三唑类抗真菌药物

第一个对曲霉有效地三唑类抗真菌药物

抗菌活性进一步增强

对接合菌（毛霉）有效1）氟康唑抗菌谱窄,对大多数念珠菌、隐球菌有效，对曲霉无抑制活性,对克柔念珠菌天然耐药；2）伊曲康唑较氟康唑抗菌谱宽,并对曲霉有抑制作用；3）伏立康唑较氟康唑抗菌谱宽,并对曲霉、镰刀菌和其它透明丝孢霉有抑制作用；4）泊沙康唑抗菌谱最宽,对念珠菌,曲霉、镰刀菌、接合菌和其它透明丝孢有效。 吡咯类药物耐药作用机制改变靶位蛋白与抗真菌药的亲和力：

唑类药物作用的靶酶是14-α-去甲基化酶，由ERG11基因编码。ERG11的突变可以改变14-α-去甲基化酶的氨基酸序列，当这种改变足以影响酶分子的空间构型时，酶分子与药物分子间的亲和力可能被削弱，导致菌株耐药。由于甾醇去饱和酶的失活使真菌细胞膜对抗真菌剂的通透性下降，使药物不能进入真菌内。真菌对药物的外排的作用增强，使唑类药物在细胞内的浓度达不到有效作用浓度。吡咯类耐药的多药耐药泵多药泵相关基因:（CDR1，CDR2）和MDR1的过度表达有关MDR1、CDR1、ERG11一定的次序出现：NDR1编码的mRNA出现于耐药的早期

EGR11编码的mRNA出现于耐药的中后期

CDR1基因编码的mRNA升高出现于耐药的后期；（3）丙烯胺类抗真菌药物抑制角鲨烯环氧化酶而干扰麦角固醇的生物合成，最终引起细胞死亡。包括：萘替芬、特比萘芬浅表真菌感染的外用药物：对皮肤癣菌如发癣菌（红色发癣菌、须疮癣菌、断发癣菌、堇色发癣菌）、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌有杀菌活性，对念珠菌有抑菌活性。3）作用于真菌核酸合成：5－氟胞嘧啶（5－FC）

灰黄霉素

5－氟胞嘧啶（5－FC）通过真菌细胞的渗透酶系统进入细胞内，转换为氟尿嘧啶，替代尿嘧啶进入真菌的脱氧核糖核酸中，从而阻断核酸的合成。 抗真菌谱窄，仅对酵母菌(新型隐球菌)和酵母样菌(念珠菌属)有较高的活性。临床上很少单独使用，常同与其他抗真菌药物合用

真菌耐药性的产生机制：（1）真菌细胞内药物累积减少；（2）药物靶酶产生增多或靶酶结构改变；（3）靶酶的缺失，导致细胞代谢途径的改变；（4）生物被膜形成；（5）细胞壁的合成障碍；（6）细胞应激反应。真菌药物体外敏感试验测定病原真菌对抗真菌药物的敏感性或者测定抗真菌药物对病原真菌的抑制活性的体外试验方法方法：稀释法、琼脂扩散法体外活性测定指标最低抑菌浓度（MIC）：是抑制某种细菌或真菌生长的最低药物浓度。常用MIC90和MIC50来描述。

-MIC90是指某种药物能够抑制90%被测菌株生长的MIC

-MIC50是指某种药物能够抑制50%被测菌株生长的MIC最低杀真菌浓度（MFC,minimum

fugicideconcentration

）

-杀死一定百分比（经典杀灭率为90%、98%、99%）真菌的最低药物浓度。1684210.50.250.125.0625.0313C1C2MIC&MFCMICMFC真菌药敏试验测定方法肉汤液基稀释法—CLSIM27-A2，M38-A琼脂稀释法纸片扩散法—CLSIM44-AE－test法标准化药敏方法需考虑—培养基菌接种量培养条件/方法药物质控标准化的药敏方法NCCLS（美国临床实验室标准化委员会），现已改名临床和实验室标准研究所（CLSI）制定的标准是普遍接受的标准M27－A2酵母菌肉汤稀释法体外抗真菌药敏试验参考方法M38－A丝状真菌肉汤稀释法体外抗真菌药敏试验参考方法M44－A酵母菌纸片扩散法抗真菌药敏试验EUCAST标准（EuropeanCommitteeforAntibioticSusceptibilityTesting）肉汤稀释法可以提供更多的有关菌体对各种不同抗生素的定量信息，特别是可以给出相关抗生素的具体的抑菌浓度。

-使用肉汤稀释法进行不同药物的抗菌活性的检测时，需将待测菌加到一系列试管中，其中含有定量浓度的经倍比稀释的药物，如稀释前的药物浓度为64ug/ml,其后每次取出前一管体积一半的液体加入等体积的培养基再次进行稀释，即倍比稀释使药物含量变为32ug/ml,如此反复。1684210.50.250.125.0625.0313C1C264321684210.50.250.125C1C2倍比稀释（Two-folddilution）新型隐球菌72小时其余菌株48小时读取MIC结果

+纸片扩散法是将含有定量抗真菌药物的纸片置于接种定量真菌的平皿中，在一定温度下经过一定时间孵育后，通过测量抑菌圈的大小来判断受试真菌对于该药物的敏感性；该方法简单直观，已有商品化试剂；缺点是不能精确量化。琼脂稀释法是将一定量的真菌接种于含有不同浓度抗真菌药物的平皿中，在一定的温度下经过一定时间孵育后，判断受试真菌对于该药物的敏感性该方法简单，但用药量大，而且难以精确量化，尤其对于抑真菌剂E-test真菌药敏试条生产商 ABBIODISK，瑞典 原理 属琼脂扩散法的改良，培养基采用RPMI1640加2%的葡萄糖和1.5%的琼脂糖，用MOPs调节pH到7.0。药敏纸片采用包被梯度浓度抗真菌药物的试纸条。 适用范围念珠菌、隐球菌和丝状真菌 检测药物 包括两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和酮康唑 MICE-test检测曲霉的MIC将不同量的抗真菌药物包被在特殊试剂条上，该方法操作简单、直观，与NCCLS法有较好的一致性判断抗真菌药敏试验的结果真菌对抗真菌药物是敏感还是耐药的判断，主要是通过将试验得出的MIC值同确定的药折点（breakpoint）进行比较分析得出，不同药物的折点有不同的标准，常用的是是由NCCLS/CLSI制定的标准。折点是根据抗真菌药物抑制真菌生长所需要的MIC。结合常用剂量时该药在人体内所能达到的血药浓度划分病原真菌对各种抗真菌药物敏感和耐药的界线。是根据体外试验对药物在人体的临床疗效作出的预测。根据折点判断结果敏感(S)耐药(R)中介(I)剂量依赖性敏感（S-DD）S-DD：Susceptible-DoseDependent剂量依赖性敏感，是指提高给药剂量后，血液及组织中的药物浓度仍可高于MIC浓度，即体内敏感。判断抗真菌药的敏感性和耐药性NCCLS/CLSI肉汤稀释法测定念珠菌体外敏感试验的临界浓度判读MIC（μg/ml）敏感S剂量依赖性敏感SDD中介I耐药R氟康唑<=816->=32伊曲康唑*<=0.1250.25-0.5->0.5氟胞嘧啶<=4-8-16>16伏立康唑<=12->=4判断抗真菌药的敏感性和耐药性NCCLS/CLSI纸片扩散法测定念珠菌体外敏感试验的临界浓度判读抑菌菌直径（mm）敏感S剂量依赖性敏感SDD耐药R氟康唑>=1915-18<=14伏立康唑>=1714-16<=13抗真菌药的疗效受多种因素的影响体内组织浓度感染部位的病原菌浓度疾病诊断的准确性疾病的严重性，有无并发症机体的免疫功能不良反应的耐受性其它的治疗措施抗真菌体外药敏试验的临床意义药敏试验对临床有一定指导意义抗真菌药敏试验与抗真菌治疗疗效的相关性尚未明确不能单纯根据其MIC值来预测临床疗效真菌体外药敏试验方法尚未完全成熟由于疾病和人体的复杂性，很难确定体外抗菌活性和临床治疗结果之间的关系体外抗真菌药敏试验与体内疗效“90-60原则”—MIC值与临床疗效药敏试验敏感菌株：90%对治疗有效药敏试验耐药菌株：60%对治疗有效

临床抗真菌药物耐药现况在临床上，真菌感染率的上升，提高了对抗真菌药物的使用率，随之而来耐药菌株也不断增多，给临床的治疗带来一定的困难；最近科学家证实：某些能够引起致命感染的曲霉菌对目前的抗真菌药已有耐药性，而且这种耐药性正以惊人的速度蔓延。抗真菌药物的化学分类分类代表药物中文名外文名多烯类两性霉素BAmB唑类（吡咯类）咪唑类第一代咪康唑Miconazole第二代酮康唑Ketoconazole三唑类第一代伊曲康唑氟康唑IRCFlu第二代伏立康唑普沙康唑拉夫康唑VRCPosaconazoleRavuconazole嘧啶类氟胞嘧啶Flucytosine丙烯胺类特比萘芬Terbinafi