医学分子生物学原理之蛋白质的研究历史与方法

蛋白质的研究历史与方法第一节蛋白质研究的历史回顾

蛋白质是一类重要的生物大分子，protein字源出自希腊文，是“最原初的”，“第一重要的”意思

19世纪30年代中期以前，认识其化学元素组成情况及原子之间结合比例，即确定经验性的分子式

蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的具有特定空间结构的高分子含氮化合物组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和S

有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘

H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度等电点(isoelectricpoint,pI)

pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性离子阳离子阴离子在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，氨基酸分子呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点

1937年，A.W.k.Tiselius

建立了研究蛋白质的移动界面电泳(electrophoresis)方法,于1948年获诺贝尔化学奖

1941年，A.J.P.Martin和R.L.M.Synge建立了分配层析(partitionchromatography)技术，被授予1952年的诺贝尔化学奖

TheNobelPrizeinChemistry1948"forhisresearchonelectrophoresisandadsorptionanalysis,especiallyforhisdiscoveriesconcerningthecomplexnatureoftheserumproteins"ArneW.K.TiseliusUppsalaUniversity

Uppsala,Sweden

1902-1971TheNobelPrizeinChemistry1952"fortheirinventionofpartitionchromatography"ArcherJ.P.MartinRichardL.M.Synge

1/2oftheprize1/2oftheprizeNationalInstituteforMedicalResearchLondon,UnitedKingdom

RowettResearchInstituteBucksburn(Scotland),UnitedKingdom1910-20021914-1994

1953年，F.Sanger利用纸层析和纸电泳技术第一次揭示出牛胰岛素的一级结构，开创了以后数千种蛋白质序列分析的先声，被授予1958年诺贝尔化学奖

TheNobelPrizeinChemistry1958"forhisworkonthestructureofproteins,especiallythatofinsulin"FrederickSanger

UniversityofCambridge

Cambridge,UnitedKingdom

1918–2013年11月TheNobelPrizeinChemistry1980"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA""fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids"PaulBerg1/2oftheprizeStanfordUniversityStanford,CA,USA1926-WalterGilbertFrederickSanger1/4oftheprize1/4oftheprize

HarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USAMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom1932-1918-2013年11月

J.C.Kendrew(1958)及M.F.Perutz(1960)利用X射线技术解析了肌红蛋白(myoglobin)和血红蛋白(hemoglobin)的三维结构，使人们第一次能够洞察生物大分子的空间结构，共同赢得了1962年的诺贝尔化学奖

TheNobelPrizeinChemistry1962"fortheirstudiesofthestructuresofglobularproteins"

MaxFerdinandPerutz1/2oftheprizeMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom1914-2002JohnCowderyKendrew1/2oftheprizeMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom1917-1997

20世纪70年代中后期，GunterBlobel利用体外蛋白质翻译系统发现动物细胞中很多分泌蛋白的跨膜方式，提出“信号假说”(signalhypothesis)，获得了1998年的诺贝尔生理医学奖

20世纪50年代后期，E.W.Sutherland发现细胞内cAMP的存在，1971年被授予诺贝尔生理医学奖

70年代末80年代初，A.G.Gilman和M.Rodbell独立发现G蛋白的存在，因此二人在1994年获得诺贝尔生理医学奖“信号转导”(signaltransduction)TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1994"fortheirdiscoveryofG-proteinsandtheroleoftheseproteinsinsignaltransductionincells"AlfredG.GilmanMartinRodbell1941-1925-1998UniversityofTexas,SouthwesternMedicalCenterDallas,TX,USANationalInstituteofEnvironmentalHealthSciencesResearchTrianglePark,NC,USA

60年代，P.Mitchell提出“化学渗透学说”，获1978年获诺贝尔化学奖

70年代，P.D.Boyer提出“结合改变机制”；90年代，J.E.Walker测定ATP合酶的晶体结构，他们共享了1997年的诺贝尔化学奖

揭示能量转化机制TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1993"forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistry"MichaelSmith1944-1932-2000LaJolla,CA,USAKaryB.MullisUniversityofBritishColumbiaVancouver,Canada"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method""forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"Nature1998;391:806-811.

Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.

WhatRogerKornberghimselfhasnowdoneistodescribehowthegeneticinformationiscopiedfromDNAintowhatiscalledmessenger-RNA

Kornberghaddescribedhowgeneticinformationistransferredfromamothercelltoitsdaughters.

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2007"fortheirdiscoveriesofprinciplesforintroducingspecificgenemodificationsinmicebytheuseofembryonicstemcells"MarioR.CapecchiSirMartinJ.EvansOliverSmithies

USAUnitedKingdomUSA

UniversityofUtah

SaltLakeCity,UT,USA;HowardHughesMedicalInstitute

b.1937

(inItaly)

CardiffUniversity

Cardiff,UnitedKingdom

b.1941UniversityofNorthCarolinaatChapelHill

ChapelHill,NC,USAb.1925

(inUnitedKingdom)

TheNobelPrizeinChemistry2008"forthediscoveryanddevelopmentofthegreenfluorescentprotein,GFP"OsamuShimomuraMartinChalfieRogerY.Tsien

1/3oftheprize

1/3oftheprize

1/3oftheprize

USA

USA

USAMarineBiologicalLaboratory(MBL)

WoodsHole,MA,USA;BostonUniversityMedicalSchool

Massachusetts,MA,USAb.1928

(inKyoto,Japan)ColumbiaUniversity

NewYork,NY,USAb.1947UniversityofCalifornia

SanDiego,CA,USA;HowardHughesMedicalInstituteb.1952

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2008"forhisdiscoveryofhumanpapillomavirusescausingcervicalcancer""fortheirdiscoveryofhumanimmunodeficiencyvirus"HaraldzurHausen

FrançoiseBarré-Sinoussi

LucMontagnier

1/2oftheprize

1/4oftheprize

1/4oftheprizeGermanyFranceFranceGermanCancerResearchCentre

Heidelberg,Germanyb.1936RegulationofRetroviralInfectionsUnit,VirologyDepartment,InstitutPasteurParis,Franceb.1947WorldFoundationforAIDSResearchandPreventionParis,Franceb.1932化学奖：/nobel/chemistry/chemistry.html/nobel_prize/chemistry/

生理/医学奖：

/nobel/medicine/medicine.html/nobel_prizes/medicine/Summary(1)

分离纯化蛋白质

测定蛋白质分子质量蛋白质结构分析蛋白质生物学活性分析探索结构与功能的关系Summary(2)

学科交叉分子生物学是一门实践性、应用性强的学科

生化方法学是在不断发展的

蛋白质样品的提取目的蛋白的获取直接从生物体内获取基因工程表达重组蛋白采用免疫学方法获取相关抗体获取蛋白质的编码序列(cDNA)基因组测序基因组测序进行推导获取部分肽段氨基酸序列捕获相应蛋白质经典的细胞蛋白质分离纯化流程由下述主要步骤组成：清洗组织或细胞裂解细胞离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质离心、层析、电泳等进一步纯化获取产物蛋白一、细胞的破碎各种组织和细胞的常用破碎方法细胞破碎方法组织种类

旋刀式匀浆大多数动、植物组织手动式匀浆柔软的动物组织高压匀浆细菌、酵母、植物细胞研磨细菌、植物细胞高速珠磨细胞混悬液酶溶细菌、酵母去垢剂渗透组织培养细胞有机溶剂渗透细菌、酵母超声破碎细胞混悬液低渗裂解红细胞、细菌冻融裂解培养细胞

二、去污剂处理溶解膜蛋白

去污剂为双极性(amphipathic)脂类分子，可在水中溶解。通常由线性或带有分枝的碳氢化合物尾部和结构各不相同的亲水性头部组成SDSTritonX-100NP-40Tween-20三、蛋白质分子的稳定

在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解PMSF(35ug/ml)EDTA(0.3mg/ml)Pepstatin(0.7ug/ml)Leupeptin(0.5ug/ml)Aprotinin(500unit/ml)

目的：保证蛋白质的生物活性

细胞内有许多种还原成分，一旦细胞破碎由于和氧的接触以及稀释作用而使抗氧化成分减少，导致许多蛋白质被氧化而失去活性，如巯基蛋白

常用的还原剂

抗坏血酸巯基乙醇(mercaptoethanol)

二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)

蛋白质的环境因素

表面效应温度储存四、离心去除细胞碎片五、目标蛋白的纯化

1.盐析

(saltingout)2.离子交换层析3.凝胶过滤层析4.亲和层析蛋白质的检测和鉴定光谱学特性190～200nm230～300nm电泳检测SDSIEF分子量测定凝胶过滤层析沉降平衡超速离心动态弹性光散射孔径梯度电泳质谱氨基酸序列测定用抗体检测蛋白质蛋白质免疫印迹免疫共沉淀一类是测定溶液中蛋白质分子的结构

如核磁共振(NMR)、圆二色谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法以及氢同位素交换法

另一类是测定晶体蛋白质的分子结构

如X射线衍射分析法、小角中子衍射法

蛋白质空间结构分析蛋白质分子的生物学功能研究基因敲除技术细胞转染技术酵母双杂交系统蛋白质研究的发展趋势一、单个蛋白质到所有蛋白质全方位生物学，高通量研究1.蛋白质组学一种细胞或一种组织在某种状态条件下所有蛋白质的定性和定量分析的研究思路。2.蛋白质芯片技术二、从统计行为到单个分子行为三、从体外活性到体内功能每一种蛋白质至少都有一种构象在生理条件下是稳定的，并具有生物活性，这种构象称为蛋白质的天然构象。蛋白质的天然折叠决定于3个因素1.蛋白质的氨基酸序列2.与溶剂分子(一般是水)的相互作用3.溶剂的pH和离子组成蛋白质结构的基础一、蛋白质的天然构象二、稳定蛋白质三维结构的作用力a离子键b氢键c疏水键d范德华引力

三、多肽主链的空间限制

(一)酰胺平面与α-碳原子的二面角(φ和ψ)

(二)可允许的φ和ψ值：拉氏构象图二面角

(φ和ψ)所规定的构象能否存在取决于两个相邻肽单位中非共价键合原子之间的接近有无阻碍。（四）二级结构：多肽链折叠的规则方式二级结构：是指多肽链借助主链基团（C＝OH－N）形成氢键排列成有规则的构象。α螺旋、β折叠片层、β转角和无规则卷曲。四、二级结构：多肽链折叠的规则方式

(一)α-螺旋

1950年美国Pauling等人在研究纤维状蛋白质时，提出了α-螺旋，后来发现在球状蛋白质分子中也存在α-螺旋。

α-螺旋结构要点：①蛋白质多肽链像螺旋一样盘曲上升，每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，每圈螺旋的高度为0.54nm，每个残基沿轴向高度0.15nm，螺旋上升时，每个残基沿轴旋转100º。②

在同一肽链内相邻的螺圈之间形成氢链。③α-螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白质绝大部分是右手螺旋，到目前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋。α-螺旋的稳定性主要靠氢键来维持。四、二级结构：多肽链折叠的规则方式影响α-螺旋形成的因素一些侧链基团虽然不参与螺旋，但可影响α-螺旋的稳定性。在多肽链中连续的出现带同种电荷的极性氨基酸，α-螺旋就不稳定。（Lys、Glu）在多肽链中只要出现pro，α-螺旋就被中断，产生一个弯曲（bend）或结节（kink）。Gly的R基太小，难以形成α-螺旋所需的两面角，所以和Pro一样也是螺旋的最大破坏者。肽链中连续出现带庞大侧链的氨基酸如Ile，由于空间位阻，也难以形成α-螺旋。四、二级结构：多肽链折叠片的规则方式(二)β-折叠片也是pauling等人提出来的，它是与α-螺旋完全不同的一种结构。①β-折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折叠的片层。②α碳原子位于折叠线上，在两条相邻的肽链之间形成氢链。四、二级结构：多肽链折叠的规则方式(二)β-折叠片③β-折叠有平行和反平行的两种形式:平行的β-折叠疏水侧链位于平面的两侧，反平行时疏水侧链位于平面的同一侧。四、二级结构：多肽链折叠的规则方式(三)β-转角(β-turn)β-转角是指蛋白质的分子的多肽链经常出现180º的回折，在回折角上的结构就称β-转角，也称发夹结构，或称U形转折。由第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的N—H之间形成氢键。四、二级结构：多肽链折叠的规则方式(四)无规卷曲无规卷曲是指没有规律性的肽链结构，但许多蛋白质的功能部位常常埋伏在这里。四、二级结构：多肽链折叠的规则方式

Ω环存在于球状蛋白质中的一种新的二级结构，这种结构的形状象希腊字Ω，所以称Ω环。Ω环特征：1、由不超过16个残基(最常见的是由6—8个残基)组成的肽段；2、这个肽段改变了蛋白质肽链的走向，构成Ω环的首尾两个残基间的距离小于1nm。五、纤维状蛋白质

分布在动物(脊椎动物和无脊椎动物)体内存在大量纤维状蛋白质。功能为结构蛋白，纤维状蛋白质是动物体的基本支架和外保护成分。含量占脊椎动物体内蛋白质总量的一半以上。形状外形呈纤维状或细棒状。分类不溶性(硬蛋白)和可溶性两类不溶性纤维状蛋白角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白可溶性纤维状蛋白肌球蛋白和血纤蛋白原五、纤维状蛋白质角蛋白(keratin)来源于外胚层细胞，是外胚层细胞的结构蛋白质。角蛋白包括皮肤以及皮肤的衍生物：发、毛、鳞、羽、翮(hé鸟翎的茎)、甲、蹄、角、爪、啄等。角蛋白可分为α-角蛋白和β-角蛋白两类。(一)α-角蛋白五、纤维状蛋白质丝心蛋白(fibroin)

是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白的性能丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性。具有0.7nm的周期。丝心蛋白的构象丝心蛋白是典型的反平行β折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象。侧链交替地分布在折叠片的两侧。反平行β折叠片以平行的方式堆积成多层结构。链间主要氢键连接，层间主要靠范德华力维系。(二)丝心蛋白和其他β-角蛋白：β-折叠片蛋白质五、纤维状蛋白质(三)胶原蛋白：一种三股螺旋五、纤维状蛋白质(四)弹性蛋白弹性蛋白(elastin)是结缔组织中的另一种蛋白质。它的最重要性质就是弹性，因此得名。弹性蛋白使肺、血管特别是大动脉管以及韧带等具有伸展性。弹性蛋白与胶原蛋白的不同点弹性蛋白只有一个基因，胶原蛋白每种亚基都有自己的基因；弹性蛋白富含Gly、Ala、Val和Pro。弹性蛋白是由可溶性单体合成的，它是弹性蛋白纤维的基本单位，称原弹性蛋白。Lys的赖氨酰氧化酶的催化氧化脱氨成醛基，3个这样Lys和未被修饰的Lys形成类吡啶啉锁链素和异锁链素交联体。使原弹性蛋白交联成网。五、纤维状蛋白质(四)弹性蛋白六、超二级结构和结构域(一)超二级结构由若干个相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多的、有规则的二级结构组合或二级结构串，在多种蛋白质中充当三级结构的构件，称为超二级结构。六、超二级结构和结构域(二)结构域（Structuraldomain,domain）多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是独立的紧密球状实体称为结构域。铁氧还蛋白（一个结构域）功能域（酵母已糖激酶2个结构域）六、超二级结构和结构域(二)结构域（Structuraldomain,domain）(2)多肽链折叠中的手性效应发夹右手左手右手左手六、超二级结构和结构域(二)结构域（Structuraldomain,domain）(2)多肽链折叠中的手性效应马鞍形扭曲片平行β桶六、超二级结构和结构域(二)结构域（Structuraldomain,domain）(3)结构域类型反平行α螺旋结构域(全α结构)平行或混合型β折叠片结构域(α,β结构)反平行β折叠片结构域(全β结构)富含金属或二硫键结构域七、球状蛋白质与三级结构(一)球状蛋白质的分类1.全α结构(反平行α螺旋)蛋白质2.α,β结构(平行或混合型β折叠片)蛋白质3.全β结构(反平行β折叠片)蛋白质4.富含金属或二硫键（小的不规则）蛋白质七、球状蛋白质与三级结构(二)球状蛋白质三维结构的特征

1.蛋白质分子含多种二级结构元件

2.三维结构具有明显的折叠层次

3.分子是紧密的球状或椭球状实体

4.疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面

5.球状蛋白质分子的表面有一个空穴八、膜蛋白的结构膜蛋白是膜的功能分子膜蛋白质与纤维状蛋白质及球状蛋白质结构不同膜蛋白质可分为膜周边蛋白质和膜内在蛋白质膜周边蛋白质(peripheralprotein)实际上属于可溶性球状蛋白质，它们分布在膜双脂层的表面，主要通过与膜内在蛋白质的静电相互作用和氢键键合相互作用与膜结合。膜内在蛋白质(integralprotein）是与脂双层强缔合的膜蛋白。它们有的一部分或大部分埋入脂双层，有的横跨脂双层。脂锚定蛋白质（lipidanchoredprotin）这些蛋白质与膜的缔合是通过各种共价连接的脂锚钩实现的。八、膜蛋白的结构（一）膜内在蛋白质1.具有单个跨膜肽段的膜蛋白人血型糖蛋白人白细胞结合蛋白八、膜蛋白的结构（一）膜内在蛋白质2.具有7个跨膜肽段的膜蛋白（G蛋白偶联受体）细菌的紫膜质八、膜蛋白的结构（一）膜内在蛋白质3.β桶型膜蛋白－膜孔蛋白麦芽糖膜孔蛋白八、膜蛋白的结构（二）脂锚定膜蛋白1.酰胺连接的豆蔻酰锚钩2.硫酯连接的脂肪酰锚钩：3.硫醚连接的异戊二烯锚钩：4.糖基磷脂酰肌醇锚钩八、膜蛋白的结构（二）脂锚定膜蛋白1.酰胺连接的豆蔻酰锚钩：cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基，HIV－1的gag蛋白等八、膜蛋白的结构（二）脂锚定膜蛋白2.硫酯连接的脂肪酰锚钩：转铁蛋白受体、某些病毒的表面糖蛋白受体等八、膜蛋白的结构（二）脂锚定膜蛋白3.硫醚连接的异戊二烯锚钩：酵母交配因子，核纤蛋白等八、膜蛋白的结构（二）脂锚定膜蛋白4.糖基磷脂酰肌醇锚钩：真核生物细胞表面抗原。粘着分子和细胞表面水解酶，原核中未见。九、蛋白质折叠和结构预测(一)蛋白质的变性物理因素：热紫外线照射、高压、微波和表面张力等。化学因素：有机溶剂、脲、胍、酸和碱等生物活性的丧失；内部的侧链暴露；物理化学性质发生改变；生物化学性质发生改变，易被酶水解等。变性剂：脲素和盐酸胍；十二烷基磺酸钠（SDS）。九、蛋白质折叠和结构预测(二)氨基酸序列规定蛋白质的三维结构1.核糖核酸酶的变性与复性实验2.二硫桥在稳定蛋白质构象中的作用九、蛋白质折叠和结构预测(三)蛋白质折叠1.蛋白质折叠不是通过随机搜索找到自由能最低的构象2.用于研究折叠中间体的一些方法3.蛋白质折叠经过熔球态的中间体阶段4.体内蛋白质折叠有异构酶和伴侣蛋白质参加

二硫键异构酶（PDI）分子伴侣（MolecularChaperone）

Hsp70蛋白－ATP酶结构域和肽结合结构域九、蛋白质折叠和结构预测图5-46(一)蛋白质的变性(二)氨基酸序列规定蛋白质的三维结构1.核糖核酸酶的变性与复性实验2.二硫桥在稳定蛋白质构象中的作用(三)蛋白质折叠的热力学(四)蛋白质折叠的动力学1.蛋白质折叠不是通过随机搜索找到自由能最低的构象2.用于研究折叠中间体的一些方法3.蛋白质折叠经过熔球态的中间体阶段4.体内蛋白质折叠有异构酶和伴侣蛋白质参加(五)蛋白质结构的预测1.二级结构的预测Glu、Met、Ala、Leu在α螺旋中出现频率高。Gly、Pro、Ser、Thr、Asn、Ile不利于α螺旋的形成；Gly、Pro在β转角中很高。Val、Ile及芳香族氨基酸在β折叠片中频率高。而Asp、Glu、和Pro则很低。Chou和Fasman二级结构预测的经验规则：（残基倾向性因子）Pi=Ai/Ti

(1)α螺旋预测：4/6→4,Pα≥1.03,Pα>

P

β(2)β折叠预测：3/5→4(3)β转角预测：Pt≥1.0,>Pα和

P

β其他预测法：GOR算法，多序列列线预测，基于神经网络的序列预测，混合方法等。2.三级结构的预测—折叠的计算机模拟九、蛋白质折叠和结构预测十、亚基缔合和四级结构图5-46(一)蛋白质的变性(二)氨基酸序列规定蛋白质的三维结构1.核糖核酸酶的变性与复性实验2.二硫桥在稳定蛋白质构象中的作用(三)蛋白质折叠的热力学(四)蛋白质折叠的动力学1.蛋白质折叠不是通过随机搜索找到自由能最低的构象2.用于研究折叠中间体的一些方法3.蛋白质折叠经过熔球态的中间体阶段4.体内蛋白质折叠有异构酶和伴侣蛋白质参加(一)有关四级结构的一些概念蛋白质的四级结构球状蛋白质通过非共价键彼此缔合在一起，形成的聚集体，就是蛋白质的四级结构。亚基或单体四级结构的蛋白质中每个球状蛋白质称为亚基，有时也称单体(monomer)。亚基一般是一条多肽链。寡聚蛋白质由两个或两个以上亚基组成的蛋白质统称为寡聚蛋白质。很多酶和转运蛋白质是寡