第11章 荧光分析法

第十一章荧光分析法主讲:阿合买提江荧光分析法概述当物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动能级返回到基态能级时所发射出的光称为荧光(fluorescence)根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法称为荧光分析法(fluorometry)

【内容提要】1、荧光分析法的基本原理。2、荧光定量分析方法。3、荧光分光光度计和其他荧光分析技术。第一节荧光分析法的基本原理

一、分子荧光（一）分子荧光的产生

1、分子的电子能级与激发过程

分子的基态激发单重态：S激发三重态：T电子能级的多重性:M=2s+1

s为总自旋量子数单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。单重态与三重态单重态(sigletstate,S)：总自旋量子数s=1/2+(-1/2)=0;多重性M=2s+1=1基态(S0)三重态(tripletstate,T)：s=1/2+1/2=1；M=2s+1=3激发单重态(S)激发三重态(T)

2、荧光的产生

振动弛豫：它是指在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为10-12s数量级。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫S0S2S1T1吸光1吸光2振动弛豫在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。

荧光、磷光能级图→振动弛豫内转移

当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。右图中指出，处于高激发单重态的电子，通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态的最低振动能级。S0S2S1T1吸光1吸光2内转移

荧光、磷光能级图荧光发射

处于第一激发单重态中的电子跃回至基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。注意：基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，λ3的波长较激发波长λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长λ3为的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s内完成。

S0S2S1T1吸光1吸光2荧光3荧光

荧光、磷光能级图外转移指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。荧光与磷光的根本区别：

荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。体系间跨跃指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。S0S2S1T1吸光1吸光2荧光3体系间跨跃荧光、磷光能级图

磷光发射

电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光，这个跃迁过程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10-4-10s。因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。S0S2S1T1吸光1吸光2荧光3磷光磷光荧光、磷光能级图(二)激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线

荧光物质分子具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱。

绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制激发光谱曲线。固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷光光谱曲线。激发波长发射波长——荧光物质分子的两个特征光谱激发光谱(excitationspectrum)：F~ex

荧光光谱(fluorescencespectrum)：F~em

荧光光谱的普遍特性：（1）斯托克斯（Stokes）位移

在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。

荧光发射波长总是大于激发光波长！

（2）荧光光谱的形状与激发波长无关。

因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子激发态，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及振动弛豫回到第一电子激发态的几率较高，远大于由高能激发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层，所以荧光发射光谱与激发波长无关。

（3）镜像规则

通常荧光光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能层形成的。其形状决定于第一电子激发态中各振动能层的分布情况。

二、荧光与分子结构

（一）荧光寿命和荧光效率1.光量子产率（荧光效率）荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示

=发射荧光分子数/激发分子总数或=发射荧光量子数/吸收光量子数在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移，系间窜跃和外转移等。很明显，荧光的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。2.荧光寿命除去激发光源后分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间（二）、荧光与有机化合物的结构

分子产生荧光必须具备的条件：（1）具有合适的结构，能吸收强的紫外可见光；（2）具有一定的荧光效率。（1）、共轭效应实验证明，容易实现激发的芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少（仅少数高度共轭体系化合物除外）。此外，增加体系的共轭度，荧光效率增大。共轭效应使荧光增强的原因：主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。长共轭结构（芳香环、稠环或杂环）共轭系统↑→f↑→ex、em↑

ex=327nm，em=510nm稠芳环分子的几何排列对荧光的影响

含有长共轭双键的脂肪烃

(2)、刚性平面结构实验发现，多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。

刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（3）、取代基效应化合物荧光相对强度苯10苯酚18苯胺20苯甲酸3硝基苯0给电子基团：如–OH,–OR,–NH2,–CN，–NR2等，

增强荧光。吸电子基团：如–COOH,,–NO2,–NO等，

减弱甚至熄灭荧光。（三）荧光试剂作用：产生强荧光性产物1.荧光胺2.邻苯二甲醛3.1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘4.测定无机离子的荧光试剂（三）影响荧光强度的外部因素1.温度

温度上升使荧光强度下降。其中一个原因是分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。2.溶剂

一般情况，荧光波长随溶剂极性的增强而长移，荧光强度增强。

3、溶液pH值

带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH有关。不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有所不同，因此，它们的荧光强度与溶液的pH值有关。4、溶液荧光的猝灭

荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度降低或荧光强度与浓度不成线性关系的现象。

1.碰撞猝灭，A：荧光物质分子与猝灭剂分子；B：荧光物质分子间的碰撞。

2.生成不发生荧光的配合物。

3.单重态变为多重态。

4.氧的熄灭作用。5、散射光本节内容小结荧光光谱的特征斯托克斯位移(Stokesshift)荧光发射波长总是大于激发光波长。荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱与激发光谱呈镜像关系物质分子能发射荧光的两个必要条件

有强的紫外-可见吸收荧光效率（f）要大有机化合物分子结构与荧光的关系长共轭结构共轭系统↑→f↑→ex、em↑分子的刚性和共平面性共轭系统的刚性和共平面性↑→f↑联苯f=0.2芴f=1.08-羟基喹啉8-羟基喹啉镁1-二甲氨基萘-7-磺酸盐1-二甲氨基萘-8-磺酸盐

f=0.75f=0.03位阻效应取代基供电子基：

–NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN

→f

↑，F↑吸电子基：-NO2、-COOH、-NHCOCH3、

-C=O、-NO、-SH、-X→f

↓，F↓，甚至荧光熄灭-R、-SO3H、-NH3+→对f

无影响一、荧光强度与物质浓度的关系前提：ECL≤0.05

稀溶液分析法

高灵敏度比例常数荧光效率激发光强度第二节荧光定量分析方法溶液中荧光物质被激发后，向各个方向发射荧光，为避免干扰应该在垂直于激发光源的方向检测荧光强度二、定量分析方法1．标准曲线法配成一系列标准溶液，测定这些溶液的荧光强度，以荧光强度为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线。绘制时，常采用系列中某一标准溶液作为基准，将空白溶液的荧光强度读数调至0％，将该标准溶液的荧光强度读数调至100％或50％，然后测定系列中其它各个标准溶液的荧光强度。

2．比例法3.联立方程式法第三节荧光分光光度计和其他荧光分析技术一、荧光分光光度计光源第一单色器第二单色器激发荧光样品池检测系统荧光光度计示意图荧光检测器光源与检测器呈90度角，以避开激发光、杂散光的干扰，增加检测灵敏度。I0IfIt紫外－可见检测器分光系统(双单色器)第一单色器作用：选择激发波长第二单色器作用：分离出荧光发射波长样品池四面透光荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别

紫外-可见分光光度计荧光分光光度计光路光源仪器校正吸收池入射光与吸收光同方向入射光与荧光垂直方向两种光源(紫外+可见)一种光源(紫外)空白溶液(F=0)荧光对照品溶液(F=100%或50%)空白溶液(T=100%)紫外无吸收两面透光低荧光材料四面透光（一）光源

常见的光源有氙灯和高压汞灯。其功率为100-500w之间。（二）单色器激发单色器用于荧光激发光谱的扫描和选择激发波长；发射单色器用于扫描荧光发射光谱及分离荧光发射波长。（三）样品池荧光测量用的样品池通常用四面透光的正方形石英池。（四）检测器普遍使用的是光电倍增管做检测器，新一代的仪器用电荷耦合元件检测器，可一次获得荧光二维光谱。其他荧光分析技术激光荧光分析时间分辨荧光分析

(time-resolvedfluorometry)同步荧光分析胶束增敏荧光分析激光荧光分析时间分辨荧光分析(time-resolvedfluorometry)原理：激发和检测之间延缓一段时间，具有不同荧光寿命的物质分别检测激发光源：脉冲激光优点：检测时排除干扰，无需化学预处理激发光源：波长更短、强度更大的激光优点：提高灵敏度(样品量<1l或10-16~10-14g)和专一性用途：生化样品、气体样品及有机化合物的自由基同步荧光分析原理：=exmax-emmax→同步荧光光谱→同步信号Fsp(ex,em)=KCFexFem用途：多核芳香族化合物胶束增敏荧光分析原理：胶束溶液的增溶、增稳、增敏作用优点：提高荧光物质溶解度、稳定性及灵敏度胶束溶液：一定浓度(>临界胶束浓度CMC)的表面活性剂溶液亲水基疏水基本章小结1．基本概念：

荧光：物质分子接受光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光称为荧光。

振动弛豫：物质分子吸收能量后，跃迁到电子激发态的几个振动能级上。激发态分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。

内部能量转换（简称内转换）：当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。

荧光发射：处于激发单重态的分子，通过内转换及振动弛豫，返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。

外部能量转换（简称外转换）：在溶液中激发态分子与溶剂分子及其他溶质分子之间相互碰撞而以热能的形式放出能量的过程。

体系间跨越：在某些情况下处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化，分子由激发单重态跨越到激发三重态的过程。

磷光发射：经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在此三重态的最低振动能级存活一段时间后返回至基态的各个振动能级而发出的光辐射。

激发光谱：是荧光强度（F）对激发波长（λex）的关系曲线，它表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。

发射光谱（称荧光光谱）：是荧光强度（F）对发射波长（λem）的关系曲线，它表示当激发光的波长和强度保持不变时，在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。

2．基本原理

（1）荧光是物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。荧光分析法具有灵敏度高、选择性好的优点。

（2）荧光光谱具有如下特征：荧光波长总是大于激发光波长、荧光光谱的形状与激发波长无关、荧光光谱与激发光谱存在“镜像对称”关系。

（3）能够发射荧光的物质应同时具备的两个条件：物质分子必须有强的紫外-可见吸收；物质分子必须有一定的荧光效率。

（4）在荧光法测定时常有散射光存在，主要有瑞利散射和拉曼散射。瑞利散射：光子和物质分子发生弹性碰撞，不发生能量的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，其波长与入射光波长相同。拉曼散射：光子和物质分子发生非弹性碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发生能量的交换，发射出比入射光稍长或稍短的光。波长比入射光更长的拉曼散射光对荧光测定有干扰。采取一定的措施（如选择适当的波长或溶剂）可消除拉曼光的干扰。

（5）荧光法常被用于定性和定量分析，但其定量应用更为广泛。荧光分析法定量的依据是：当ECL≤0.05时，F=2.3K’I0ECl=KC。可采用的定量分析方法有：标准曲线法、比例法、联立方程式法。

（6）用于荧光法测定的仪器是荧光分光光度计，其主要部件包括：激发光源、激发单色器（置于样品池前）和发射单色器（置于样品池后）、样品池及检测系统。

（7）为进一步提高荧光分析法灵敏度和选择性，发展了其他的荧光分析技术，主要有激光荧光分析、时间分辨荧光和同步荧光分析等。1、永停滴定法的检测信号是：A、电动势B、电解电流C、电压D、电导E、电量（B）2、下列关于π－π＊跃迁吸收的特征说法正确的是：A、吸收波长小于200nmB、吸收波长小于100nmC、摩尔吸光系数非常小D、比吸光系数很小E、共轭键越长，吸收所需能量越小

（E）复习题3、下列哪种检测器不能用于紫外－可见分光光度计A、光电池B、光电管C、光电倍增管D、光二极管阵列检测器E、真空热电偶（E）4、氘灯的发射波长为A、100-200nmB、200-300nmC、200-400nmD、400-500nmE、400-800nm（C）5、紫外区定量分析时，应选用下列哪种材料的样品池A、石英B、水晶C、玻璃D、玛瑙E、塑料（A）6、由于化合物改变或其它原因，使吸光度减小的现象为A、增色效应B、减色效应C、酸效应D、盐效应E、同离子效应

（B）7、芳香族化合物的特征吸收带是A、R带B、K带C、B带D、E带E、B带和E带

（E）8、分子从（）的最低振动能级以发光的形式回到基态所发的光称为荧光A、第一激发单重态B、第二激发单重态C、第三激发单重态D、第一激发三重态E、第二激发三重态

（A）9、分别在320nm、360nm光照下记录硫酸奎宁的荧光光谱，下列说法正确的是A、两荧光光谱形状不同，发光强度也不同B、两荧光光谱形状不同，发光强度相同C、两荧光光谱形状相同，发光强度也相同D、两荧光光谱形状相同，发光强度不同E、两荧光光谱的强度大小与激发波长无关

（D）10、关于荧光