二维凝胶电泳和质谱技术

双向凝胶电泳和质谱技术刘东TEL:68771960E-mail:liudong@163.com全军免疫学研究所主要内容双向凝胶电泳的原理双向凝胶电泳的流程双向凝胶电泳的局限性和进展双向凝胶电泳的应用质谱的定义离子源（ESI和MADLI）质量分析器（四级杆，离子阱，TOF,FT-ICR)质谱图的意义和解析导课HumanProteomeOrganization,HUPO蛋白质组：阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的存在方式（修饰形式），研究其结构、功能、定量和相互作用等蛋白质组研究策略蛋白质1蛋白质2蛋白质3。。。组织、细胞等蛋白质分离双向凝胶电泳分离色谱分离切取蛋白条带或蛋白点蛋白混合物多肽混合物MS/MS数据库比对酶解质谱鉴定目前唯一能分离上千种蛋白的技术蛋白质分离首选技术：

双向凝胶电泳技术小鼠肝细胞细胞系K562人肾脏细胞ExtractionofproteinIsoelectricfocusing(1Dgel)Ettan™IPGphor™stainingSpotexcision;TrypsindigestionSDSMALDI-TOF双向电泳研究流程图1.1.1电泳的基本知识电泳的定义：带电粒子在直流电场中向着所带电性相反的电极移动的现象。影响电泳的因素：1．带电粒子的带电状态（电量和电性）。2．带电粒子的分子量大小和分子形状。3．电场强度。4．缓冲液的PH值，组成成分及离子强度。5．支持介质的吸附和电渗作用。蛋白质电泳的原理一：蛋白质是两性电解质：在不同的pH条件下，所带电荷不同。当蛋白质各种带电离子所带正电荷数与负电荷数相等时,此时溶液的pH就是这种蛋白质的等电点(pI).

不同蛋白质等电点不同，在同一缓冲液中所带电性及电量不同，电泳时迁移的方向和速率不同。

1.1.2蛋白质电泳的基本知识阴极阳极pH=pIpH<pIpH>pI带正电荷带负电荷净电荷为零电泳分离蛋白质电泳的原理二：不同蛋白质分子量大小和分子形状不同，故迁移率不同。1.2.1等电聚焦定义等电聚焦（IEF)：利用一种特殊的缓冲液（两性电解质）在聚丙烯酰胺凝胶上制造一个pH梯度，电泳时，蛋白迁移到其等电点就不带电荷而停止电泳，通过该方法分离蛋白的方法。+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH101.2.2固相pH梯度等电聚焦

（IEFwithIPG）

IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3~10不同值的缓冲体系。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。

1.3.1二维SDS同普通SDS类似。但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶

1.3.2SDS的基本原理样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。如何实现从蛋白质分子量大小来分离蛋白?SDS：阴离子去污剂变性剂助溶性试剂作用:断裂分子内和分子间的氢键破坏蛋白质分子的二级和三级结构强还原剂:

巯基乙醇

DTT作用:

破坏半胱氨酸之间的二硫键分子被解聚成组成它们的多肽键侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。胶束在SDS系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。

蛋白质-SDS胶束的特点:形状像一个长椭圆棒;短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的;长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比SDS2.二维电泳基本操作流程样品准备等电聚焦（IEF,第一维）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS,第二维)染色图像分析质谱分析数据库分析，鉴定蛋白裂解液:8M尿素4%CHAPS50mM

DTT2%IPGbuffer40mMTrisbase2.1样品准备细胞株或组织细胞裂解液振荡裂解超声破碎离心,去除沉淀上清蛋白定量2-DE样品2.2IPG胶条的水化和上样2-DEsample水化液水化液组成:8MUrea2%NP-40orCHAPS2%IPGbuffer(Ampholyte)0.28%DTTTraceBromophenolblueIPGstripholderPositiontheIPGstrip2.2IPG胶条的水化和上样StripholderCathode(-)electrodeAnode(+)electrode30voltage12hr2.3第一向:等电聚焦1.Placeelectrodepads2.200Vstep-n-hold1.5hr3.500Vstep-n-hold1.5hr4.1000Vgradient1500vhr5.8000Vgradient36000vhrTimeVoltageHoldercoverIPGstripElectrodeElectrodepads2.4第二向:SDSSDS平衡SDSSDSequilibrationbuffer50mMTris-HCl6MUrea30%Glycerol2%SDSTraceBromophenolSDSSDSSDS0.5%agaroseinrunningbufferSDSMarkerinpaperIPGstrip2.5常用检测蛋白的方法Colorimetricstaining(考马斯蓝染色,银染)BlottingIsotopicmethods（同位素）Chemiluminescentmethods(化学发光）Fluorescentmethods（分子荧光）2.6凝胶的图像处理分析和典型流程凝胶图像的扫描图像加工斑点检测和定量凝胶配比数据分析数据呈递和解释2-DE数据库的建立2.7蛋白点获取人工切胶自动切胶仪2.8蛋白鉴定蛋白斑点的酶解（将蛋白切成肽段）凝胶内酶切电洗脱后在溶液中酶切电转移到膜上在膜上酶切在印迹过程中酶切质谱分析MADLI-TOFESI-MS-MS…...3.二维电泳存在问题低丰度蛋白点的检测极酸或极碱性蛋白的分离高分子质量区蛋白的分离膜蛋白的提取和有效分离重复性和灵敏度问题4.二维电泳研究进展虚拟二维电泳：IPG＋MADLI－TOFSDS+MS/MS二维/多维色谱技术2-DIGE（多荧光）EttanDIGEsystemEttanDIGEsystem-2如何鉴定二维电泳分离出来的蛋白点？质谱与蛋白质对于蛋白质的“鉴定”，较早期的方法是利用Edman测序，但利用这些技术花費的时间较长；如Edman测序，一天只能鉴定出1-2个peptides对于研究蛋白质组学的研究员来說，要用这些传统的方法来解出自然界中成千上万的蛋白质结构，实在是天方夜谭。

高通量鉴定蛋白的方法：质谱什么是质谱？质谱的定义质谱(MS)技术是利用离子化的帶电物体在磁场或电场中的行为确定其分子量，利用这些质量信息对分子进行鉴定的技术。

质谱鉴定蛋白的一般方法ArtificialspectrabuiltArtificiallytrypsinatedDatabaseofsequences(i.e.SwissProt)SpotremovedfromgelFragmentedusingtrypsinSpectrumoffragmentsgeneratedMATCHLibrary数据及供电系统┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓进样系统离子源质量分析器检测接收器┗━━━━━╋━━━━━━┛

真空系统

质谱仪包含了五个主要的系统：1、进样系统(sampleintroduction)2、离子源系统(ionizationsource)3、质量分析仪(massanalyzer)4、离子探测器(detector)5、数据处理系统(datasystem)。质谱仪的基本结构离子源电离：

质谱进行分析时，首先要做的就是离子化，也就是將待测物处理过后产生气相的离子，並带有电荷。离子源:

使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置,并对离子进行加速使其进入分析器，根据离子化方式的不同,分为硬电离和软电离。常见的电离方式硬电离：

EI(ElectronImpactIonization):电子轰击电离CI(ChemicalIonization):化学电离FD(FieldDesorption):场解吸FAB(FastAtomBombardment):快原子轰击软电离：

ESI(ElectrosprayIonization):电喷雾电离MALDI(MatrixAssistedLaserDesorption):基质辅助激光解吸电离APCI(AtmosphericPressureChemicalIonization):大气压化学电离为什么不能使用硬电离方式分析蛋白分子？硬电离方式破坏化学键硬电离方式破坏蛋白质，生成氨基酸、氨基酸碎片、多肽等复杂的组合物一个单一的蛋白质，其硬电离质谱会产生10,000种不同的峰--toocomplextoanalyze诺贝尔奖的提示对离子源的贡献—软电离方式目前有两种做法能使得蛋白质转变为气态离子而不会改变其结构与形态。由JohnB.Fenn所发展的方法是运用一个很強的电场將試样喷洒出去(ESI)，而产生一个个帶电荷並能自由飞翔的离子。运用一个強烈的激光脉冲，在适当的条件下(視能量，与试样的結构和化学环境而定)运作，试样可接受激光脉冲的能量而被释放成为自由的离子(MALDI)，由KoichiTanaka最先提出的技术。软电离方式337nmUVlaserMALDIcyano-hydroxycinnamicacidGoldtipneedleFluid(nosalt)ESI+_电喷雾电离质谱术

ESI（Electrosprayionisation）RayleighLimitReached++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--Evaporation++ChargedDroplets试样离子准分子离子AnalyteIonsSolventIonClustersSalts/IonpairsNeutrals++++++++--其他离子ESI电离机制阳离子或阴离子模式?如果样品具有容易接收H+的功能团(例如氨基化合物、肽和蛋白质上所带的氨基)，那么使用正离子检测法。如果样品具有容易失去H+的功能团(例如羧酸、核酸和糖上所带的羟基)，那么使用负离子检测法。溶液pH值的高低，控制了样品的官能基（functionalgroup）离子化的狀況。pH值高于5，C-terminal的部份才会离子化，pH值低于7的時候，N-terminal的氢才会游离，lysine和arginine的N端通常要低于pH3.5才会离子化，这表示在酸性溶液中（如pH3.5或更低）会使蛋白质帶正電，在碱性环境中則让蛋白质帶負電，ESI一般都在酸性环境下分析帶正電的peptideion。蛋白质分子带电荷电喷雾电离毛细管直径0.1~0.2mm。

喷雾电压：毛细管尖端与离子引入口之间，3~8kV。

壳气(Sheathgas),从毛细管端与喷雾反向加热后流出。离子通过取样锥(Skimmer)和毛细管(Capillary)传送至光学聚焦系统。电喷雾电离的基本过程ReproducedfromKebarle,P.J.MassSpectrom.2000,35,804-817.

电场下的喷雾带电雾滴壳气的作用下溶剂的蒸发电荷的库仑作用带电雾滴的解体

Rayleigh极限表面张力和库仑斥力的平衡点电喷雾电离产生多电荷离子：可以用质谱仪的小的质量范围测定大的生物分子，相当于将质谱仪的质量范围放大的n倍。多电荷离子的有关计算对于蛋白质，产生的多电荷离子为：[M+nH]n+，系列离子假设某一质谱峰(m/z)1对应的离子为[M+nH]n+,另一相邻质谱峰(m/z)2对应的离子为[M+(n+1)H](n+1)+,且两个峰均为同一蛋白质产生，则可通过建设联立方程组来得到M和n的具体数值:解方程组得到M和n。可以编制程序将所有相关的峰进行计算并取平均值，则可得到较精确的分子量信息。这一过程称作解卷积(Deconvolution)。肌红蛋白电喷雾质谱图带10~30个电荷的系列分子离子影响ESI因素：样品的pKa和溶液的pH。在低pH值条件下有利于样品分子质子化，提高pH导致灵敏度和分子所带电荷的数目减少。在正离子检测中，溶液pH通常至少低于样品的pKa2个单位。在负离子检测中，溶液pH比样品pKa高2个单位。溶剂的性质。溶剂应具有较低的汽化点，有较低的黏度和表面张力。去溶剂时干燥气体的温度和流速。应保持较高的温度及流速以利于去溶剂。但也应注意过高的温度可能导致样品分解。不能使用不挥发的无机盐缓冲液作为ESI的溶剂。ESI小结：样品引入方式：a).流动注射.b).LC/MS接口c).流速一般小于1mL/min优点：a).离子性,极性化合物;b).[M+nH]n+或[M-nH]n-c).m/z小于4000;d).低化学噪音;e).容易获的碎片离子信息f).MS/MS缺点:a).不能分析非极性化合物;b).金属离子干扰,Na,Kc).离子源结构复杂,质量范围:分子量可达1000,000Da基质辅助激光解吸电离技术MALDI

(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization)

基质辅助激光解吸电离(MALDI)试样溶解或悬浮于基质中，激光束辐射到基质和试样分子上。基质吸收激光束能量后汽化，部分试样分子伴随基质的汽化而解吸。基质吸收大部分激光能量，减少了试样分子被激光能量破坏及过度电离成碎片离子。激光：固体氮激光，紫外光波长：337nm

功率：106~108W/cm2

脉冲时间：10-6~10-9秒关于基质：极性化合物溶解样品芳环吸收激光易结晶均匀分散样品分子

MALDI常用基质基质性状适用波长应用烟酸固体266nm,2.94m,10.6m蛋白质2,5-二羟基苯甲酸固体266nm,2.94m,10.6m蛋白质芥子酸固体266nm,337nm,355nm,2.94m蛋白质-氰基-4-羟基肉桂酸固体337nm,355nm蛋白质3-羟基吡啶甲酸固体337nm,355nm核酸、配糖体2-(4-羟基苯偶氮)苯甲酸固体266nm,337nm蛋白质、配糖体琥珀酸固体2.94m,10.6m蛋白质、核酸间硝基苄醇液体266nm蛋白质甘油液体2.94m,10.6m蛋白质邻硝苯基辛基醚液体266nm,337nm,355nm合成高分子能够嵌入样品分子间并能起到隔离样品分子之间的相互作用(如形成共结晶);能溶解于可溶解样品分子的溶剂;在真空状态下是稳定的;可吸收激光,既与激光形成共振吸收;可激发样品分子离子化。MALDI基质应具有的特性

样品引入方式：a).直接进样

优点：a).快速获得分子量的信息;b).快速获得混合肽的肽谱.缺点:a).金属离子干扰,Na,K；b).离子源结构复杂,；c).没有LC/MALDI接口；d).实现MS/MS困难e).需要基质质量范围:分子量小于500,000DaMALDI小结：MALDIANDESIMALDI固相高能离子轰击单电荷离子基质离子易操作ESI液相强电场多电荷离子污染离子操作相对复杂质量分析器Massanalysis质量分析器是质谱仪的核心,它将离子源产生的离子按其质荷比(m/z)的不同﹑在空间的位置﹑时间的先后或轨道的稳定与否进行分离,以便得到按m/z大小顺序排列而成的质谱图。两组四极杆分别加上+(u+Vcont)和–(u+Vcont)，其中u直流电压部分，Vcont为射频电压部分=2f,f为频率。一、四极杆质量分析器(QuadrupoleMassAnalyser)在场的中心和两条对角线上的任何一点电位为零。通过直流和射频电压的改变来控制不同荷质比的离子通过；可以允许单一荷质比的离子通过；也可以进行荷质比扫描massscanningmodem1m3m4m2m3m1m4m2singlemasstransmissionmodem2m2m2m2m3m1m4m2四级杆扫描模式离子在四级杆中的稳定性三重四级杆离子阱质谱由四极杆质谱仪发展而来。四极杆变为环极，四极杆两端加端帽。端帽和环极上均加有直流电压U，射频电压(振幅为V，角频率)。二、离子阱质量分析器(IonTrapMassAnalyser,IT)二级质谱：捕集(Trapping)，排除(Elimination)捕获(Capture)，碰撞(Collision)扫描(Scanning)检测(Detection)多级质谱：上述步骤的重复过程。Trapping1Elimination2Capture3Collision4Scaning5离子阱的多级质谱分析三、飞行时间质量分析器(TimeOfFlightMassAnalyser,TOF)离子源中的离子经加速电压获得的速度为：其中ze为电荷，V为加速电压，m为质量。飞行管长度L，到达检测器的时间为：质量越大，飞行时间越长，实现分离。m1和m2两个离子：用已知样品进行校正，得到未知离子的质量。反射式或折射式：靠电场将飞行的离子反射回来，在反射端接有检测器。好处：提高分辨力和灵敏度。对灵敏度的提高：中性分子也会在电离过程中产生，并飞向检测器，但中性分子不能被反射，不能到达反射检测器所在位置，减小本底噪音，提高灵敏度。对分辨率的提高：速度快的离子动能相对较大，克服电场阻力的能力大，打入