第七章模拟酶

第七章模拟酶

第七章模拟酶7.1模拟酶的概念酶，是自然界经过长期进化而产生的生物催化剂。它能在温和条件下高效专一地催化某些化学反应。设计一种像酶那样的高效催化剂是科学家们一直追求的目标之一。对酶功能的模拟是当今自然科学领域中的前沿课题之一。酶是高效的催化剂，它的应用日趋广泛。但是，酶对热的敏感性，稳定性差，来源有限等缺点限制了它的规模开发和利用。于是，新的催化剂——模拟酶就逐渐被研制和开发了。在过去的20年里，化学家对利用简单的分子模型构建酶的特征进行了深入的研究。这除了它的应用前景之外，另一个主要原因是化学模型可以帮助我们认识酶的作用机制，即酶为什么具有如此高的催化效率。事实上，在生物体内，对酶能催化的许多反应的详细了解是来自于模拟酶的研究结果。广义上讲，模拟酶就是用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂。模拟酶研究吸收了酶分子中那些起主导作用的因素，利用有机化学、生物化学等方法，设计和合成一些比天然酶简单的非蛋白分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程，也就是说，在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机制和立体化学等特性。近30年来，由于蛋白酶结晶学、X衍射技术及光谱技术的发展，人们对许多酶的结构有了较深入的了解。动力学方法的发展以及对酶的活性中心、酶抑制剂复合物和催化反应过渡态等结构的描述促进了酶作用机制的研究进展，为人工模拟酶的发展注入了新的活力。目前，较为理想的小分子仿酶体系有环糊精、冠醚、环番、环芳烃和卟啉等大环化合物等。大分子仿酶体系有聚合物酶模型、分子印迹酶模型和胶束酶模型等。此外，科学家们利用化学修饰、基因突变等手段改造天然酶产生了具有新的催化活性的半合成人工酶，而抗体酶的出现和快速发展为酶的人工模拟又开辟了新的道路。7．1．1环糊精酶模型可以作为人工酶模型的主体分子虽有若干种，但迄今被广泛采用且较为优越的是环糊精。环糊精（cyclodextrin,CD）是由多个D-葡萄糖以α（1,4）糖苷键结合而成的一类环状低聚糖（图5.1）。根据葡萄糖单元的数量不同可分为α（6个）、β（7个）、γ（8个）环糊精三种，它们均是略呈锥形的圆筒，其伯羟基和仲羟基分别位于圆筒较小和较大开口端。这样，CD分子外侧是亲水的，其羟基可与多种客体形成氢键，其内侧是C-3，C-5上的氢原子和糖苷氧原子组成的空腔，故具有疏水性，因而能包结多种客体分子，很类似酶对底物的识别。以CD为催化剂可使酯水解加速10~10倍。图5.1环糊精结构示意图56CD分子和底物的结合常数可达10L/mol，不及某些酶对底物的结合常数大，因此以CD为主体的仿酶研究工作过去主要集中在对CD的修饰上，即在CD的两面引入催化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，以改善CD的疏水结合和催化功能。这样得到的修饰CD通常只有单包结部位和双重识别作用。由于酶是通过对底物的多部位包结并具有多重识别位点来实现酶促反应的高效性和高选择性的，为了增加环糊精的仿酶效果，近年来相继出现了桥联环糊精和聚合环糊精。以它们为仿酶模型可以得到双重或多重疏水结合作用和多重识别作用，其结合常数可达10L/mol或更高。这样的结合常数已超过了单一CD仿酶模型和一些酶对底物的结合常数，而且相当于中等亲和力的抗体对抗原的结合常数，这为环糊精的仿酶研究创造了条件。利用环糊精为酶模型已对多种酶的催化作用进行了模拟。在水解酶、核糖核酸酶、转氨酶、氧化还原酶、碳酸酐酶、硫胺素酶和羟醛缩合酶等方面都取得了很大的进展。48（1）水解酶的模拟α-胰凝乳蛋白酶是一种蛋白水解酶。它具有疏水性的环状结合部位，能有效包结芳环，催化部位中含有57号组氨酸咪唑基、102号天冬氨酸羧基及195号丝氨酸羟基，三者共同组成了所谓的电荷中继系统，在催化底物水解时起关键作用。Bender等将实现了电荷中继系统的酰基酶催化部位引入CD的第二面，成功地制备出人工酶Benzyme，如1所示。它催化对叔丁基苯基乙酸酯（p-NPAc）的水解比天然酶快1倍以上，Kcat/Km也与天然酶相当。β-Benzyme曾以实现了天然酶的高效催化作用机制而闻名于世。组氨酸咪唑基在酶催化中起着重要作用，将咪唑与环糊精相联结会获得更理想的模拟酶。Rama等将咪唑在N上直接与β-CD的C-3相连，所得的2催化p-NPAc的水解比天然酶快一个数量级。美国著名科学家Breslow在环糊精仿酶领域做了大量而出色的工作。他认为模拟酶增加催化效率的关键是要增加环糊精对底物过渡态的结合能力。最简单的方法是通过修饰底物来增加底物同CD的结合，从而可能增加对过渡态的结合。他们设计了一系列对二茂铁、金刚烷为结合位点的硝基苯酯（如3）。（2）核糖核酸酶的模拟核糖核酸酶是两个组氨酸咪唑基及一个质子化赖氨酸氨基处于活性中心，在它的催化下RNA的磷酸酯水解分两步进行，两个咪唑基交替起着一般酸和一般碱的作用，使离去基团质子化或增加亲核基团的亲核性。Breslow等设计合成了两种环糊精（4、5）用于催化环状磷酸二酯的水解。这两种修饰CD被认为是很好的核糖核酸酶：如图5.2的反应式所示，当A在碱性条件下水解时，同时产生B和C两种产物，而在4的催化下水解反应只生成C；相反，5催化水解反应只生成B。这里环糊精底物复合物的几何形状和催化基团所处的位置对反应的选择性起了决定性的作用。两种模型的活性均呈现pH最佳值（约为6），说明其中的一个咪唑基以碱的形式，而另一个咪唑基则以质子化形式参加反应，这与天然酶的作用机制一致。图5.24和5催化环状磷酸二酯的水解反应（3）转氨酶的模拟磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺是许多涉及氨基酸的酶促转化的辅酶，其中最重要的是转氨酶催化的酮酸与氨基酸之间的相互转化。吡哆醛（胺）本身也能实现转氨作用，但由于辅酶本身无底物结合部位，反应速度远不如酶存在时快。显然，有效的转氨酶模型除了具有辅酶体系外，还应有特定的结合部位，这种结合部位能够选择性地与底物形成复合物。1980年报道了第一个人工转氨酶6。在它的存在下，苯并咪唑基酮酸转氨基速度比吡哆胺单独存在时快200倍，而且表现出良好的底物选择性。CD空腔能稳定结合类似亚胺中间体的过渡态是提高催化速度的关键。由于β-CD本身具有手性，可以预料产物氨基酸也应该具有光学活性，事实上，产物中D、L异构体的含量确实不同，说明该人工酶有一定的立体选择性。6的不足之处在于它不具备催化基团。Tabushi等将催化基团氨基引入CD得到模拟酶7。乙二胺的引入不仅使反应加速2000倍以上，还为氨基酸的形成造就了一个极强的手性环境。靠近乙二胺一面的质子转移受到抑制，从而表现出很好的立体选择性。（4）桥联环糊精仿酶模型桥联CD是近年来发展起来的一类新型仿酶模型，它的两个CD及桥基上的功能基构成了具有协同包结和多重识别功能的催化活性中心，能更好地模拟酶对底物的识别与催化功能。Matsui等将乙二胺偶联到CD上，然后与铜盐作用形成桥联环糊精8。它催化糠偶姻9氧化糠偶酰的反应，其催化速率kcat为1.1min，比没有催化剂时大20倍。8的两个CD协同包结糠偶姻的两个呋喃环，同时糠偶姻的烯醇负离子通过与桥基铜离子的静电或配位作用得以稳定，从而加速了反应。-1Breslow近年来在桥联CD方面做了较多工作，不仅报道了一系列桥联CD的合成方法和疏水结合能力，还成功地将10用于催化双疏水部位酯底物11的水解反应。底物11被两个CD包结后，配位于桥基的Cu正好处于底物酯基的附近，有利于OH-对酯基的进攻，因而显著地加速了水解反应。其催化速率比无催化剂时提高2.2×10倍。52+谷胱甘肽过氧化物酶(GPX，EC1.11.9)为含硒酶，是生物体内重要的抗氧化物酶，能有效消除体内的自由基，同超氧化歧化酶和过氧化氢酶共同作用，防止脂质过氧化。因而在治疗和预防克山病、心血管病、肿瘤等疾病具有明显效果。但是，此酶的来源有限、稳定性差，以及分子质量大等缺点，限制了它的实际应用，因此，人们把注意力集中在对此酶的工人模拟上。为克服以往GPX模拟物如PZ51无底物结合部位的缺点，罗贵民等利用环糊精为底物结合部位，硒为催化基团，制备出双硒桥联环糊精（12）。最近，他们又制备出含碲环糊精（图5.3），其GPX活力高达46U/μmol,用线粒体损伤模型所做的抗氧化损伤实验表明，含碲环糊精具有很强的抗氧化能力，显示了良好的应用前景。图5.3含碲环糊精合成示意图7．1．2合成的主-客体酶模型主-客体化学和超分子化学的迅速发展极大地促进了人们对酶催化的认识，同时也为构建新的合成酶创造了条件。除天然存在的宿主酶模型（如环糊精）外，人们合成了冠醚、穴醚、环番、杯芳烃等大环多齿配体用来构筑酶模型。目前，科学家已经获得了很多较成功的人工模拟酶。合理的人工酶的设计首先是优化对底物的结合，其次是催化基团的定位。早期以冠醚和环番为宿主的合成酶，尽管没有获得高效催化作用，但却明显加速了反应速度。日本学者Koga等采用冠醚为主体，合成了带有巯基的仿酶13。利用此模型可在分子内实行准双分子反应以合成多肽。此模型具有结合两个氨基酸的能力。Lehn等制备了一个含有半胱氨酸残基的大环手性模拟酶14。它具有与伯铵盐络合的能力，分子内的巯基将结合的二肽酯巯解。例如它对甘氨酰苯甲氨酸对硝基苯酯盐L-异构体有较大的选择催化能力。伯铵盐在冠醚孔穴中的络合以及半胱氨酸巯基的参与可以生成S-酰化中间体，致使酯的水解速率提高10~10倍。这种人工模拟酶兼具分子络合作用、手性识别作用和催化作用，与天然酶十分类似。34含氮大环聚胺质子化可以作为一种阴离子受体模拟酶的模型。Lehn等合成了一种优异的穴状配体-冠-N6O2（15）。它可利用电性作用力和氢键结合多聚磷酸阴离子。研究表明，此酶模型在PH2.5~8.5之间可明显水解ATP生成ADP或AMP，在催化过程中形成磷酰胺中间体，当pH7时可加速ATP水解500倍。在水溶液中，多氢键结合作用不足以结合底物，但在有机相中功能化的宿主可以很好地以氢键与底物结合，从而发挥催化作用。Hamilton等将巯基偶联到可形成氢键的受体上，它可与底物硝酸酯（16）以氢键定向结合，催化基团巯基恰好与酯的羧基临近，从而可快速结合并分解2，4-二硝基苯酯，其催化效率约提高10倍。研究表明，催化基团巯基如果通过柔性连接基团与宿主偶联，则表现出相当低的催化效率，这表明，优良的酶模型应当具有一定的刚性，除结合外，要尽量使催化基团与底物反应基团临近。4最出色的合成配体可能是Cram等制备的球状17，它由环状尿素联结而成孔穴状结合。球状模型是Cram等合成的α-胰凝乳蛋白酶模拟物，它催化的目标为酰基转移反应。它与底物对硝基苯基丙氨酸酯具有强烈的结合能力，其结合常数为10L/mol。它对此底物的酰基转移反应所显示的催化能力比无结合部位的相应亲核试剂18快10倍。尽管它还不能模拟脱酰化过程，这种模拟酶的催化效率已与天然酶相当。911合成酶的成功因素之一是结合作用。如果能将两种底物结合在同一结合部位就能很好地发挥作用。Sanders等制备了系列低聚卟啉（19），它能将适当的底物结合在同一空腔内而催化二者反应。19是加速双底物发生Diels-Alder反应的例子。结合控制着反应的立体化学，在Diels-Alder反应中，反式产物是顺式产物的10倍。3多年来，化学家一直在试图制造类似酶活性部位结构的小分子，Stack合成了一个小分子模拟半乳糖氧化酶的酶模型。半乳糖氧化酶是一个单核铜酶，能将醇氧化成醛。天然半乳糖氧化酶中的铜有五个配体，两个与酪氨酸的酚基配位，两个与组氨酸的咪唑基配位，第五个配体是水。这个模型模拟了前四个配体。此外，天然酶中，在半胱氨酸的硫原子和苯酚基的芳基碳之间有一个共价硫醚键。这个模型中也包含了类似的键。按照公认的半乳糖氧化酶的催化机制，这个修饰了的苯酚配体在催化反应过程中被氧化成自由基。实验表明，这个模拟物具备了天然酶的所有特点，它催化反应的机制与天然酶完全一样。用如此简单的模型化合物能完全模拟酶的催化机制的例子还是少有的。更有意义的是，与其他醇氧化法相比，这个合成酶环境是友好的，因为反应结果只有产物和过氧化氢，而且，反应条件温和，这是其他需要大量能量的工业过程所无法比拟的。7.1.3胶束模拟酶在模拟生物体系的研究中，胶束模拟酶是近年来比较活跃的领域之一。它不仅涉及简单的胶束体系，而且对功能化胶束、混合胶束、聚合物胶束等体系也进行了深入的研究。胶束在水溶液中提供了疏水微环境（类似于酶的结合部位），可以对底物束缚。如果将催化基团如咪唑、硫醇、羟基和一些辅酶共价或非共价地连接或吸附在胶束上，就有可能提供“活性中心”部位，使胶束成为具有酶活力或部分酶活力的胶束模拟酶。下面介绍几种重要的胶束酶模型。1．模拟水解酶的胶束酶模型组氨酸的咪唑基常常是水解酶的活性必需的催化基团。如将表面活性剂分子上连接上组氨酸残基或咪唑基团，就有可能形成模拟水解酶的胶束。N-十四酰基组氨酸所形成的胶束催化对硝基苯酚乙酸酯的水解，其催化效率比不能形成胶束的N-乙酰基组氨酸高3300倍。研究发现此水解反应进行时，首先在阳离子胶束中生成一个稳定的酰基咪唑中间体。酶分子的高效性催化的一个重要特征是多功能团协同作用，如丝氨酸蛋白酶活性中心的丝氨酸上的羟基、组氨酸上的咪唑基和天冬氨酸残基上的羧基所形成的“电荷中继系统”。如果将上述含咪唑基的胶束中加入带羟基的表面活性剂N，N-二甲基-N-（2-羟乙基）十八烷基氨溴化物，让它们共同催化对硝基苯酚乙酸酯（PNPA）的水解，则发现这个酰基咪唑中间体形成后又分解，酰基从咪唑基上又转移到羟基上，与α-胰凝乳蛋白酶水解一些底物很相似。在胶束模拟酶中常用氧肟酸和肟代替羟基来研究氧负离子的亲核反应。它们催化对硝基苯酚乙酸酯（PNPA）在胶束中的水解反应，其速度常数比在非胶束中提高近万倍。氧肟酸负离子更适于碱催化的反应。如用氧肟酸与十六烷基三甲基铵溴化物（CTAB）一起催化酮醇去质子反应，其催化速度提高3000~20000倍，是OH-催化反应的60~300倍。此外，含巯基的胶束也可作为亲核试剂催化反应，如硫代胆碱类表面活性剂C15H33N（CH3)2CH2CH2SH催化PNPA水解，比C2H5SH约提高5000倍，已成为最强的一种亲核试剂。+5图5-4单分子胶束酶模型2．辅酶的胶束酶模型将疏水性维生素B6长链衍生物与阳离子胶束混合形成的泡囊体系中，在Cu存在下可将酮酸转化为氨基酸，有效地模拟了以维生素B6为辅酶的转氨基作用，氨基酸的收率达52%。色氨酸合成酶是一类维生素B6酶，它催化丝氨酸和吲哚反应转化为色氨酸。吡哆醛的长链衍生物可以使丝氨酸和吲哚反应生成色氨酸。阳离子胶束不但能活化催化基团，也能活化辅酶的功能团。例如吡哆醛催化的S-苯基半胱氨酸的消除反应在阳离子胶束中可被大大加速。(其原因可能是反应中生成的Schiff碱被胶束束缚后，继而被胶束表面上的氢氧根离子消去质子，从而完成消除反应。束缚在阳离子胶束上的黄素分子和它们的类似物（维生素B2族），可用作碳负离子和硫醇的氧化剂。硫醇可被黄素氧化成二硫化物，反应速度的决定一步是硫醇负离子对黄素的亲核进攻，此步可显著地被疏水环境所加速。)2+3．金属胶束酶模型金属胶束是指带疏水键的金属配合物单独或与其他表面活性剂共同形成的胶束体系，其作用是模拟金属酶的活性中心结构和疏水性的微环境。该体系的研究目前已取得引人注目的成绩，特别是在模拟羧肽酶A、碱性磷酸酯酶、氧化酶、转氨酶等方面取得了很大成功。胶束能够提供类似酶的疏水微环境。将金属酶的简单模型引入胶束体系，利用金属离子的特殊作用催化水解反应，而胶束所具有的疏水性微环境则对底物起包结作用。对羧肽酶A的模拟就是其中一例。Tonellato等人以α-吡啶甲酸对硝基苯酚酯（PNPP）为底物，研究了不同表面活性剂配体在Cu或Zn存在时催化PNPP水解的性能。发现Cu、Zn的存在可使PNPP的水解速度显著增大，当Cu与相应的表面活性剂形成1∶1配合物时，水解反应速度达到最大。2+2+2+2+2+7.1.4肽酶肽酶（pepzyme）就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。这是多肽合成的一大热点。Johnsson等为克服苯丙氨酸工业合成的关键步骤草酰乙酸脱羧反应所用酶中需金属辅酶的不便，想探寻与此不同反应机理的不需金属辅酶的脱羧酶。可借鉴的认识只有胺可以催化草酰乙酸脱羧，其历程是先形成烯胺，进而脱去CO2。然而尚未发现采用烯胺历程的天然脱羧酶，全新合理设计就成了惟一可行的方法。他们基于胺催化脱羧的6大特征和α-螺旋在催化活性中的重要性的认识，以烯胺机理设计出两个多肽。结果发现，其催化效率比丁胺高3~4个数量级，但比天然酶活性低得多。进而分析认为,烯胺形成并不是脱羧酶催化的限速步骤.最杰出的是，Atassi和Manshouri利用化学和晶体图像数据所提供的主要活性部位残基的序列位置和分隔距离，采用“表面刺激”合成法将构成酶活性部位位置相邻的残基以适当的空间位置和取向通过肽键相连，而分隔距离则用无侧链取代的甘氨酸或半胱氨酸调节，这样就能模拟酶活性部位残基的空间位置和构象。他们所设计合成的两个29肽ChPepz和TrPepz分别模拟了α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性部位，二者水解蛋白的活力分别与其模拟的酶相同；在水解2个或2个以上串联的赖氨酸和精氨酸残基的化学键时，TrPepz比胰蛋白酶的活力更强。对于苯甲酰酪氨酸乙酯的水解。ChPepz比α-胰凝乳白酶的活力稍小，而TrPepz则无活力。对于对甲苯磺酰精氨酸甲酯的水解，TrPepz比胰蛋白酶的活力稍小，而ChPepz则无催化活力。7.2抗体酶在Ribozyme发现五年后，1986年，美国《Science》周刊同时发表了两篇来自由Lemer和Schultz分别领导的两个研究组有关如何发现具有酶催化性质的抗体研究报告。他们用Abzyme来命名新发现的具有酶催化活性的抗体，中文译名为抗体酶。Abzyme的本质为免疫球蛋白（Ig），但是在易变区被赋予了酶的属性，所以又被称为催化抗体（Catalyticantibody）。抗体是目前已知的最大多样性体系，原始大家族有1×10结合部位，体细胞变异还可以增加1×10的结合部位。抗体有极高的亲和力，解离常数在10~10mol/L,这与酶相似，但无催化活力。酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障。人们设想以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，这种构思是成功的，近年来在哺乳动物的免疫系统中已制备了50多种催化抗体。抗体酶的应用前景十分诱人，在理论上它不仅是研究酶作用机理的有力手段，同时也为过渡态理论提供依据。84-4-147.2.1酶作用的过渡态及过渡类似物Pauling认为，酶通过某种方式与高能、短寿命的过渡态结合而起催化作用。在这个处于反应底物和产物之间的过渡态构型中，某些键在形成，另一些键在断裂。1969年，Jencks进一步发展了Pauling的理论，他认为，在结构和电荷排列两个方面，酶分子与它催化反应的过渡态呈互补，即酶分子充当化学反应的模板，使底物分子转变成新的构型——过渡态。随着反应的进行，能量平衡转向有利于能量较低的产物分子一边。而过渡态不会回到底物分子。到达过渡态的过程实际是反应的困难阶段。Pauling在提出酶催化的过渡结构理论的同时，就已提出酶和抗体的根本不同在于前者选择性地结合一个化学反应的过渡态，而抗体则是结合一个基态分子。Jencks预言，如果抗体能够结合过渡态的话，理论上它们就能获得催化性质。由于ES（过渡态中间物）的半衰期很短，约在10~10秒的范围内，实践中很难将过渡态俘获，因此，目前的做法是寻找过渡态类似物，能够模拟一个酶催化反应过渡态的结构的稳定物质被称为过渡态类似物。它能与相应的酶紧密结合而成为该酶的竞争性抑制剂。现在已有数十种酶发现了过渡态类似物，例如腺苷酸激酶的过渡态类似物为ApsA，醛缩酶的过渡态类似物为磷酸乙醇酸等。它们与酶的结合比底物还要牢固3~5个数量级，这说明它们在结构上比底物更接近在反应过程中生成的过渡态中间物。≠-10-127.2.2抗体酶的催化反应迄今为止，获得的抗体酶已能成功地催化六种类型的酶促反应和几十种类似的化学反应。这些抗体酶的催化专一性相当于或超过一般酶的反应专一性，催化速度有的也可以达到酶的催化水平，但总的来说，由于抗体与底物结合后缺乏结构的动态变化，阻碍了产物的释放。所以，目前抗体酶的催化效率还普遍低于天然酶。下面简单介绍一些抗体酶催化的反应。1酰基转移反应生物体内蛋白质合成是一个复杂过程。氨基酸在掺入肽链之前必须进行活化以获得额外能量，这活化过程即酰基转移反应（Acyltransferation），又称氨酰基化反应（Aminoacylation）。1986年，Tramonatano等研制成功首例酰基转移抗体酶。目前，该抗体酶的研制已接近实用阶段。Jacolson等设计了一个中性磷酸二酯作为反应过渡态的稳定类似物，得到的单克隆抗体可以催化带丙氨酰的胸腺嘧啶的氨酰化反应，反应速度为5.4×10(mol/L)·min-1，比无催化反应的速度提高了10倍，见图5-1。48图5-5氨酰化反应2重排反应Claisen重排是有机化合物异构化的一种重要形式，生物体由一些化合物在光照下会发生Claisen重排。Hilvert等选用的是一个有椅式构象的氧氮杂双环化合物来模拟由分枝酸生成预苯酸这样一个Claisen重排反应的过渡态结构，见图5-6。实验获得成功，反应速度加快了10~10倍。这是首次用抗体酶催化了C—C键的生成。图5-6Claisen重排反应34过渡态类似物o3氧化还原反应氧还反应在生物体内十分广泛，主要是呼吸链的一系列反应。Shokat制得了对氧化态Km=8mmol/L，对还原态Km=300nmol/L的抗体，使标准电位变为-340mv。由于黄素还原态的还原范围扩大，使一些原来无法按其还原的物质（标准还原电位差大于无抗体酶催化的黄素标准还原电位差）得以还原。这意味着抗体酶可以使热力学上原来无法进行的氧还反应得以进行。如图5—7所示。图5-7氧化-还原反应（Redox）4金属螯合反应金属螯合反应对于辅酶、辅因子和酶的结合来说意义重大。SchultzPG等用G-甲基卟啉诱导产生的抗体可催化平面状卟啉的金属螯合反应，见图5-4。这抗体不仅可催化Cu,Zn和卟啉的螯合，还可催化,Mn,Co和卟啉的螯合。实验表明，该抗体酶对其中某些金属卟啉具有很高的亲和力。意味着可研制抗体-血红素复合物为催化剂催化氧还反应,电子传递反应，见图5-8。图5-8金属整合反应2+2+2+2+5磷酸酯水解反应磷酸二酯键是自然界最稳定的键之一，因此，它的水解对抗体酶来说是个挑战。Janda等利用稳定的五配位氧代铼络合物A模拟RNA水解时形成的环形氧代正膦中间物，产生了一种单抗G12，可以催化水解磷二酯，见图5-9。催化速度常数（Kcat）=1.53×10s，米氏常数（Km）=240μmol/L。

-3-1图5-9磷酸酯水解反应6磺酸酯闭环反应Lemer等人用脒基离子化合物作半抗原，产生的抗体酶（17G8）可催化B转化为C和D混合物，见图5-10。图5-10磺酸酯闭环反应7光诱导反应光诱导反应包括光聚合反应和光裂解反应，这两类反应在植物体内尤为重要，见图5-11。图5-11A为光聚合反应，图5-11B为光裂解反应。A光聚合反应（二聚作用）（Photo-induceddimerization）图5-11A光诱导反应B光裂解反应（Photo-inducedcleavage）图5-11B光诱导反应7.2.3抗体酶的制备方法制备抗体酶的方法很多，如拷贝法、引入法、诱导法、化学修饰法和基因工程法等，这里重点介绍前三种。1拷贝法拷贝法操作步骤比较简单，见图5-12。先用已知酶作为抗原免疫动物，获得了抗酶的抗体，再将这种抗体免疫动物进行单克隆化即获得了单克隆的抗抗体，将后者进行筛选，应获得具有原酶活性的抗性（抗体酶）。拷贝法的优点是对于某些来源紧张的酶来说可以用生产单克隆抗体的方法来大量生产，不足之处是这类抗体酶需要筛选获得，具有一定的盲目性和偶然性.并且不能产生新酶.图5-12拷贝法示意图2引入法借助于基因工程和蛋白质工程方法将催化基因引入到已有底物结合能力的抗体的抗原结合位点上。具体的方法可以采用寡核苷酸定点诱变技术将特定的氨基酸残基引入抗原结合部位，使其获得催化功能。也可以采用选择性化学修饰的方法将人工合成的或天然存在的催化基团引入到抗原结合部位。如果引入的催化基团与底物结合部位取向正确、空间排布恰到好处，则就会产生高活性的抗体酶。引入催化基团的方法有：（1）利用部位选择性试剂，用类似亲和标记的的方法定向地将催化基团引入抗体；（2）用DNA重组技术和蛋白质工程技术改变抗体的亲和性和专一性，引入酸、碱催化基团或亲核体。使用这类方法的关键在于要事先对抗体的结构有所了解，确定工程化抗体的目标部位。4图5-13Schultz小组用引入法法制备抗体酶示意图3诱导法即用设计好的半抗原，通过间隔链（space）与载体蛋白（如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准的单克隆技术制备、分离、筛选抗体酶。抗体多样性的特点为研制抗体酶提供了可能.但是,什么样的抗原才能诱导出具有酶催化活性的抗体呢?这是实现抗体向酶转变的关键.而半抗原的设计原则,就是酶的催化作用机制.实际上，利用过渡态类似物制备抗体酶（图5-14），其过渡态是很不稳定的。一般反应的过渡态还只是一种理论推测，并未在结构上予以阐明。因此，实际上采用的过渡类似物（半抗原）也只能是根据推测而设计的。图5-14利用过渡态类似物制备抗体酶示意图HilvertD等人选用一个椅式构象的氧杂双环化合物作为由分枝酸（chorismicacid）生成预苯酸（prephenicacid）的过渡态类似物，诱导的抗体酶比原反应速度加快10~10倍。而且还观察到新抗体酶表现出高度的立体异构专一性，它只催化（-）一分枝酸为底物的反应，对（+）一分枝酸无作用，见图5-15。图5-15由分枝酸生成预苯酸的反应机理24过渡态类似物o前已提及，诱导法的关键在于过渡态类似物的正确设计。一般认为酯水解反应的过渡态是带电的四面体结构，因而可选用具有四面体结构的带电磷酸酯作为过渡态类似物。图5-16给出了他们使用过渡态类似物与过渡态间的关系。图5-16羧酸酯水解反应机理7.2.4发展前景抗体酶的实践已清楚表明，它是研究酶作用机理的有力工具。在抗体酶获得成功之前，支持Pauling的过渡理论的证据主要来自酶抑制剂的研究。抑制剂只能提供作用过程中结合专一性的信息，不能给出结合后发生催化反应以及结合与催化之间的关系。在抗体酶的研究过程中，可以直接观察到过渡态理论设计抗体酶起到的作用，这也就为酶的过渡态理论的正确性提供了一个有力的实验证据。除了基础理论研究的价值外，抗体酶的应用前景也令人鼓舞。Lerner指出，如将催化水解反应的抗体酶研究深入下去，极有可能得到一种新型的蛋白酶。这种新酶就能按照人们的意愿对特定的肽键进行水解。在医学上可利用抗体酶专一破坏病毒蛋白质及专一地清除体内“垃圾”。Lerner还提到将具有立体专一性的抗体酶应用于制药工业是很有前途的，它有助于避免化学合成中遇到的令人头痛的对映体拆分的难题。随着制备抗体酶新方法的不断发展，将进一步拓宽其催化反应范围。特别是对那些天然酶不能催化的反应，则可研制抗体酶来进行催化。这些抗体酶在医学上可用于诊断和治疗，如利用抗体酶基因来治疗遗传性疾病。在有机合成中，可用抗体酶解决外消旋混合物的对映体拆分等难题，这在药物、精细化工产品等生产中将发挥重要作用。抗体酶的固定化已取得初步成功，具有酯解活力的抗体酶已用于生物传感器的制造上。我们还可以设计专一性很强的多肽水解酶去破坏病毒蛋白或清除血管凝血块。抗体酶亦可用于可卡因吸毒患者的治疗，癌症药物的治疗以减少化疗的副作用。立体专一性的抗体酶用于制药工业的对映体拆分，改进合成步骤，抗体酶催化已从酰基转移反应，协同反应发展到光化学反应，氧化还原反应及交换合成反应。尽管抗体酶研究取得很大进展，但离开实际应用还有一定的距离，目前以下几个问题亟待解决。（1）催化效率。抗体酶是不对称合成的理想催化剂，其催化反应的范围十分广泛，而且还在不断扩大，然而，催化抗体现在还未达到实用阶段。对实用来说，来源，费用和可靠性都是要考虑的因素，但能否实用的关键因素是催化效率；反应的时间是否合理，反应的收率是否可以接受。与酶的催化速度相比，目前所得的大部分催化抗体的反应速度加强只能是中等水平的，其Kcat/Kuncat为10，个别可达到10，比酶催化低2—3个数量级。因此，如何提高抗体酶的催化效率，抗体酶将来能否与酶竞争是个公开挑战。3-46-7（2）抗体酶筛选。虽然用PCR和噬菌体技术构建的庞大的Fab蛋白组合库，可绕过动物免疫，直接从库中筛选有用抗体，从而大大促进抗体酶生产，但面对巨大的免疫系统资源，目前的筛选方法只能筛选其中的一小部分抗体。一般是通过对半抗原结合的大小来筛选的，而不是通过催化活性来筛选。问题是对半抗原的亲和力最大，不一定是最好的催化抗体。有人在制备含硒抗体酶时就遇到这个问题。如筛选半抗原亲和力小的抗体，其谷胱甘肽过氧化物酶活力反而高很多。因此，这是对开发通过催化活性直接筛选抗体酶的又一个挑战，但可以满怀信心地说，这个问题是能够解决的。（3）抗体酶专一性。从经济观点出发，和酶催化一样，抗体酶的高度专一性是个缺点，因为对每一个底物和每一个反应都需要不同的催化剂。因此，开发能催化多种底物的抗体显然是应用研究的追求目标。这种多用途催化抗体已出现。Lerner小组原来设计的水解四氢吡喃乙缩醛的抗体14D9，后来发现还能催化烯醇醚水解，环氧化物的形成和开环。（4）底物抑制。与过渡态最相近的两个稳定的结构是反应物和产物。与基态结合过紧，由于提高了反应活化能而使催化效率降低，与产物结合过紧则抑制转化数。后一问题对键形成反应特别严重：因为两个强束缚结构间,键的形成会加强二者的结合（螯合效应）。最好的解决办法是建立的半抗原,在结构上要与产物有显著差异。（5）催化基团的最适装配。很多化学转化需要酸、碱或亲核基团参与，这类催化残基对需能反应特别重要。现在还不能通过免疫精确地使这些基团在抗体中精确定位。Schultz小组利用抗体和半抗原间的电荷互补性，在抗体结合部位上诱导出一个具有催化活性的羧基。然而，这种方法是否具有普遍性，通过这种方法能否把2~3个这类基团引入抗体还有待证实，因此，表征对更有意义、更困难的化学转化具有中等以上活力的抗体是严峻挑战。最后，抗体酶是抗体与酶结合的产物，它的发展有赖于抗体与酶的结构的深入研究，特别是对酶作用机制的深入研究。而目前，人们对抗体、尤其对酶的认识还很肤浅，因此必要的基础理论研究还须跟上。7．3印迹酶分子印迹（molecularimprinting），属于超分子研究范畴。它是指制备对某一特定分子（模板分子或印迹分子）具有选择性的聚合物的过程。它通常被描述为制造“分子钥匙”的人工“锁”的技术。在自然界中，分子识别在生物体如酶、受体和抗体的生物活性方面发挥着重要作用，这种高选择性来源于与底物相匹配的结合部位的存在。为获得这样的结合部位，科学家们应用环状小分子或冠状化合物如冠醚、环番、环糊精、环芳烃等来模拟生物体系。那么，这样的类似于抗体和酶的结合部位能否在聚合物中产生呢？如果以一种分子充当模板，其周围用聚合物交联，当模板分子除去后，此聚合物就留下了与此分子相匹配的空穴。如果构建合适，这种聚合物就像“锁”一样对钥匙具有选择性识别作用。这种技术被称为分子印迹。早期，科学家对分子印迹进行过各种尝试，但直到20世纪七八十年代，这一技术才真正有所突破。Wulff小组在1972年首次报道成功地制备出分子印迹聚合物。后来经过二三十年的努力，分子印迹技术趋于成熟，并在分离提纯、免疫分析、生物传感器，特别是人工模拟酶方面显示出广泛的应用前景。7.3.1分子印迹原理在生物体中，分子复合物通常通过非共价键如氢键、离子键或范德华力相互作用而形成。同共价键相比，非共价键相互作用很弱，但几个或多个相互作用点会导致复合物相互作用很强，这使复合物具有很高的稳定性。早在20世纪30年代，Breinl等就提出一种产生抗体的理论，后来由Pauling做了详细说明，它的基本点是抗体在形成时其三维结构尽可能地同抗原形成多重作用点，抗原作为一种模板就会被铸造在抗体的结合部位。后来克隆选择理论否定了Pauling的抗体形成学说，但这种学说却为分子印迹奠定了理论基础。由Pauling理论出发，当模板分子与带有官能团的单体分子接触时，会尽可能同单体官能团形成多重作用点，待聚合后，这种作用就会被固定下来，当模板分子被除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间互补的具有多重作用位点的结合部位，这样的结合部位对模板分子可产生多重相互作用，因而对此模板分子具有特异性结合能力。通常，作为模板的印迹分子被恰当地包围在印迹空穴里。如果用一种纯对映体作为印迹分子，就能产生有效手性拆分的印迹聚合物。此时，该印迹空穴具有不对称结构，而这种不对称是由于被固定的聚合物链的不对称构象所产生的。一般来说，聚合物空穴对印迹分子的选择性结合作用来源于空穴中起结合作用的官能团的排列以及空穴的形状。大量研究表明，起结合作用的官能团的排列在空穴特异性结合中起决定性作用，而空穴的形状在某种程度上是次要因素。显然，分子印迹技术可以产生对底物的特异性结合部位，并可以将催化官能团以确定的排列引入结合部位，从而制备出催化活性聚合物。7.3.2分子印迹聚合物的制备方法制备分子印迹聚合物的过程一般包括：①选定印迹分子和单体，让它们之间充分作用；②在印迹分子周围发生聚合反应；③将印迹分子从聚合物中抽提出去。于是，此聚合物就产生了恰似印迹分子的空间，并对印迹分子产生识别能力。制备分子印迹聚合物的聚合方法和一般聚合方法一致。在设计分子印迹聚合体系时关键要考虑选择与印迹分子尽可能有特异结合的单体，然后选择适当的交联剂和溶剂。可用于分子印迹的分子很广泛，如药物、氨基酸、碳水化合物、核酸、激素、辅酶等，它们均已成功地用于分子印迹的制备中。分子印迹聚合中应用最广泛的聚合单体是羧酸类，如丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基苯甲酸、磺酸类，以及杂环弱碱类如乙烯基吡啶、乙烯基咪唑。其中最常用的体系为聚丙烯酸和聚丙烯酰胺体系。对金属配合作用则应用氨基二乙酸衍生物。其他可能的体系为聚硅氧烷类。分子印迹聚合物要求的交联度很高（70%~90%），因此交联剂的种类受到限制。预聚溶液中交联剂的溶解性减少了对交联剂的选择。最初，人们用二乙烯基苯作为交联剂，但后来发现丙烯酸类交联剂能制备出更高特异性的聚合物。在肽类分子印迹中三或四官能交联剂如季戊四醇四丙烯酸酯已用于聚合体系中。溶剂在分子印迹制备中发挥着重要作用，这种作用在自组织体系中尤为重要。聚合时，溶剂控制着非共价键结合的强度，同时也影响聚合物的形态。一般来说，溶剂的极性越大，产生的识别效果就越弱。因此，最好的溶剂应选择低介电常数的溶剂，比如甲苯和二氯甲烷等。另外，聚合物印迹空穴的形态学也受溶剂的影响。溶剂使聚合物溶胀，从而导致结合部位三维结构的变化，产生弱的结合。通常，识别所用溶剂最好与聚合用溶剂一致，以避免发生溶胀问题。分子印迹聚合物的形态有聚合物块、珠、薄膜、表面印迹以及在固定容器内的就地聚合等。目前最常规的工艺是制备整块聚合物，然后粉碎过筛，获得不同粒径的颗粒。应用乳液聚合、悬浮聚合和分散聚合可获得粒径均一的颗粒，可用于层析和模拟酶。浇铸膜等聚合物薄膜可用于制造传感器。按印迹分子与聚合单体的结合方法，可分为如下两种分子印迹方法。①预组织法：主要由Wulff及其同事创立。在此方法中，单体预先共价联结到印迹分子上，待聚合后共价键可逆打开，去除印迹分子。在此方法中结合部位的官能团预先与印迹分子定向排列。②自组织法：主要由Mosbach研究小组首先开发。在此方法中，印迹分子与功能单体之间预先自组织排列，以非共价键形式形成多点相互作用，聚合后这种作用保存下来。预组织分子印迹法中印迹分子与单体间可产生可逆共价结合，因此又称为可逆共价结合法。例如印迹分子苯基-α-D-甘露吡喃糖苷的羟基与乙烯基苯基硼酸可形成可逆共价结合。在大量交联剂的存在下，经自由基聚合就产生了具有大量内表面积的微孔聚合物，用酸水解则可除去印迹分子。该印迹聚合物由于对D型糖苷具有选择性识别能力，在适当的溶剂中，此聚合空腔只与D型对映体建立平衡并与之结合，从而产生拆分糖苷对映体的能力（图5.17）。图5.17预组织分子印迹中印迹分子与聚合物的结合方法同可逆共价结合法相比，基于非共价相互作用的自组织分子印迹法则优越得多，而且在聚合中可使用不同的单体共聚。印迹分子可通过非共价作用(如离子键、氢键、疏水作用和电荷转移等)与聚合物结合。例如以苯丙氨酸衍生物为印迹分子，丙烯酸为聚合单体时，所制备的印迹聚合物，其结合部位可通过离子键、氢键和疏水作用与印迹分子结合。此印迹聚合物对印迹分子具有相当高的选择性（图5.18）。图5.18自组织分子印迹中印迹分子与聚合物的结合方式（a）印迹聚合物的制备过程；（b）用此印迹聚合物拆分D，L对映体7.3.3表面分子印迹7.3.3.1无机物为载体的表面印迹在大孔硅胶表面，应用通常的分子印迹法可产生具有分子识别能力的微孔聚合薄层。类似这样在某些载体表面产生分子印迹空腔或进行表面修饰产生印迹结合部位的过程称为表面分子印迹。例如在硅胶球表面的分子印迹：首先将交联剂3-（三甲氧基硅烷基）甲基丙烯酸通过共价键结合到硅胶表面，引入聚合单体甲基丙烯酸酯，待印迹分子与单体共同包被在硅胶表面后，采用常规的聚合方式聚合，然后去除印迹分子后，就产生了具有一定粒度不溶胀的表面印迹微粒。这种印迹方法特别适于制备拆分对映体的聚合物。7.3.3.2固体材料的表面修饰图5.19硅胶表面具有一定距离的双氨基的制备7.3.4生物印迹生物印迹（bioimprinting）是指以天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。由于天然生物材料，如蛋白质含有丰富的氨基酸残基，它们与模板分子会产生很好的识别作用。显然，用这种方法可以制备生物印迹酶。7.3.4.1以蛋白质为基础的生物印迹Keyes等详细研究了利用生物印迹方法将蛋白质转化为半合成酶的过程。这些印迹蛋白有时表现出与天然酶相似的性质或被赋予了其他特性。这种制备生物印迹酶的主要过程为：①首先使蛋白质部分变性，扰乱起始蛋白质的构象；②加入模板分子，使模板分子与部分变性的蛋白质充分结合；③待模板分子与蛋白质相互作用后，用交联剂交联印迹的蛋白质；④经透析等方法除去模板分子。由于起始蛋白质与模板分子充分作用后，就产生了类似于酶的新的活性中心，从而赋予了新的酶活。对这种印迹来说，起始蛋白质既可以是无酶活性的蛋白质，如牛血清蛋白等，又可以是具有催化活性的酶，如核糖核酸酶、胰蛋白酶、葡萄糖异构酶等。模板分子通常是某种酶的抑制剂、底物修饰物或过渡态类似物等。Klibanov和Mosbach两个研究小组在这方面做了大量工作。Klibanov等将蛋白质溶解在水中，加入多官能团模板，调节pH为酸性，使蛋白质部分变性，此时模板分子与蛋白质之间可充分结合。将溶液冻干，用有机溶剂除去模板分子，就制成了生物印迹蛋白质。研究表明，此印迹蛋白质在有机相中对模板分子具有明显的选择结合能力，但在水相中这种结合能力完全消失。原因在于有机相中蛋白质的刚性保持了原来的构象，而在水中蛋白质结合模板的构象则不能保持。Mosbach等以胰凝乳蛋白酶抑制剂N-乙酰基-D-酪氨酸为印迹分子将胰凝乳蛋白酶转化为相应的酯合成印迹酶。这种印迹酶可接受N-乙酰基-D-酪氨酸为底物在有机相中合成相应的乙酯，但对映体N-乙酰基-L-酪氨酸的酯合成却不显示催化使用，表现出立体特异性。7.3.4.2糖类为基础的生物印迹Shinkai等应用环氧氯丙烷交联与某种染料分子相互作用的水溶性淀粉。除去染料分子后，非水溶性产物吸附染料的能力明显好于非印迹的交联淀粉。原因是印迹淀粉中产生了许多通透性的结合部位。7.3.5分子印迹酶分子印迹技术一出现，人们就意识到可以应用此技术制备人工模拟酶。通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，更重要的是利用此技术可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。分子印迹酶同天然酶一样，一般遵循Michaelis-Menten动力学，其催化活性依赖于Kcat/Km，这里Kcat是催化反应速率常数，而Km通常代表结合常数，它可用于描述底物与酶的亲和性。产生底物的结合部位并使催化基团与底物定向排列对产生高效人工模拟酶来说是相当重要的两个方面。7.3.5.1分子印迹酶的设计要想制备出具有酶活性的分子印迹酶，选择合适的印迹分子是相当重要的。目前，所选择的印迹分子主要有底物、底物类似物、酶抑制剂、过渡态类似物以及产物等。Mosbach等应用分子印迹法制备具有催化二肽合成能力的分子印迹酶。所合成的二肽为Z-L-天冬氨酸与L-苯丙氨酸甲酯缩合产物。它们分别以底物混合物（Z-L-天冬氨酸与L-苯丙氨酸以1︰1混合）以及产物二肽为印迹分子，以甲基丙烯酸甲酯为聚合单体，亚乙基二甲基丙烯酸酯为交联剂，经聚合产生了具有催化二肽合成能力的二肽合成酶。研究表明，以产物为印迹分子的印迹聚合物表现出最高的酶催化效率，在反应进行48h后，其二肽产率达到63%，而以反应物为印迹分子的印迹聚合物催化相同的反应时二肽产率却较低。与以过渡态类似物法制备抗体酶的原理相同，若用过渡态类似物作为印迹分子，则所得的聚合物应具有相应的催化活性，只不过以人工合成的聚合物代替了抗体。Mosbach等从过渡态类似物法制备抗体酶中得到启示，首次将过渡态类似物法应用于分子印迹中。他们以羧酸酯水解的过渡态类似物——磷酸酯作为印迹分子（图5.20），将含水解功能基团的4（5）-乙烯咪唑作为单体和双功能交联剂1,4-二溴丁烷进行分子印迹聚合，制备出具有相应酯水解能力的印迹酶，其催化水解乙酸对硝基苯酯的活性比未用印迹分子的相应聚合物高出60%。图5.20用于酯水解反应的印迹分子7.3.5.2催化活性基团的引入将催化基团定位在印迹空腔的合适位置对印迹酶发挥催化效率相当重要。通常引入催化基团的方法为诱导法，即通过相反电荷等的相互作用引入互补基团。如Shea等以苯基丙二酸为模板分子，利用酸和胺的相互作用将胺基定位在印迹空腔的适当位置上，除去印迹分子后，含胺印迹聚合物催化4-氟-4-硝基苯基丁酮的HF消除反应，其催化速率提高了8.6倍。Morihara等利用硅胶表面印迹制备印迹酶。他们用Al与硅发生置换后，在硅胶表面就形成了路易斯酸官能团。将其表面用含有路易斯碱的印迹分子为模板进行表面印迹，路易斯酸Al就被诱导在路易斯碱的邻近（图5.21）。除去印迹分子后，此表面印迹聚合物具有催化酯交换能力。如果以底物类似物为模板，所产生的印迹酶对底物的结合能力增加，Kcat相应变小，但二级反应速率常数Kcat/Km比非印迹时增大2~8倍。如果以含以四面体磷酸酯的过渡态类似物为印迹分子，所产生的印迹酶对底物的结合能力和催化速率Kcat都有所增大，其二级速率常数Kcat/Km比非印迹时增大22倍。图8.21表面印迹制备具有定向催化基团的印迹示意图3+3+7.3.6印迹酶的催化效率利用分子印迹产生的聚合物印迹酶都不同程度地加速了相应反应速率。但是，无论是印迹底物类似物还是过渡态类似物都不能充分提高催化效率。同其他方法制备的模拟酶（如抗体酶制备技术）相比,催化效率很低。如Mosbach制备的以过渡类似物为模板的聚合物印迹酶，其催化效率只提高6.8倍，而用相似的过渡态类似物为半抗原诱导的抗体酶，则具有明显的酯水解能力，可加速相应的酯水解达10倍。尽管人们采用很多手段如将催化基团引入印迹空腔，但用高聚物制备的印迹酶其催化效率普遍不高。可能的原因是，分子印迹聚合物一般是高交联聚合物，其刚性大，且缺乏酶的柔性。另外，用于聚合的单体种类较少，使模板与空腔周围基团形成次级键的作用力减少，也就是说，模板聚合物对反应底物的识别能力受到限制，因而导致酶活性普遍不高。57.4生物印迹酶在有机相中，生物印迹蛋白质由于保持了对模板分子的结合构象而对相应的底物产生了酶活性，那么，这种构象能否在水相中得以保持，从而产生相应的酶活力呢？Keyes研究小组的研究结果告诉我们，采用交联剂完全可以固定模板分子的构象，在水相中产生高效催化的生物印迹酶。利用这种方法已成功地模拟了许多酶，如酯水解酶、HF水解酶、葡萄糖异构酶等。有的甚至达到了天然酶的催化效率。7.4.1酯水解生物印迹酶1984年，Keyes等报道了首例用这种方法制备的印迹酶。它们选择吲哚丙酸为印迹分子，印迹牛胰核糖核酸酶，待起始蛋白质在部分变性条件下与吲哚丙酸充分作用后，用戊二醛交联固定印迹蛋白质的构象，经透析去除印迹分子后就制得了具有酶水解能力的生物印迹酶。此印迹酶粗酶活性为7.3U/g，而非印迹酶则无酯水解酶活性。粗酶经硫铵分级（70%~90%硫酸铵）纯化后，其酯水解比活力增至22U/g。再经柱层析（BiogelP-30）进一步纯化后，出现三种交联组分，其中低分子质量组分显示出最高酶活性，其活力达到600U/g（图5.22）。经过纯化，其回收率达25%。图8.22经柱层析分离的印迹酶的催化活性－－○－－表示蛋白质浓度；—●—表示酯水解活性其中低分子质量组分显示出最高酶活性7.4.2HF水解生物印迹酶氟水解酶是一类重要的酶。它催化含氟化合物的水解反应而使含氟有机磷和磺酸类化合物解毒。它们最常见的底物是二异丙基氟磷酸（DFP）、对甲苯基磺酰氟（PMSF）等。Keyes研究小组以不同的底物类似物为印迹分子印迹核糖核酸酶，获得了具有高活力的氟水解酶，其催化DFP的活性比相应的抗体酶高10倍，甚至超过了某些天然酶的活力水平（表1）。kcat/min-1kuncat/min-1kcat/kuncat印迹酶110.05.0×10-32.2×104抗体酶2.70×10-22.8×10-5960天然酶（猪肾）15.505×10-33100天然酶（鱿鱼神经）5855×10-31.17×105表1天然DFP水解酶、抗体酶、生物印迹酶催化效率比较7.4.3具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的生物印迹酶谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是在哺乳动物体内发现的第一个含硒酶，它以谷胱甘肽（GSH）为还原剂分解体内的氢过氧化物，因而可防止细胞膜和其他生物组织免受过氧化物损伤，对此酶的人工模拟具有重要的药用价值。GPX的酶活性中心具有GSH特异性结合部位，即GSH是此酶的特异性底物，而氢过氧化物则