基因诊断与基因治疗

基因诊断与基因治疗第一页，共四十七页，2022年，8月28日基因变异致病类型内源基因的变异由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致疾病。外源基因的入侵如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病。第二页，共四十七页，2022年，8月28日第一节

基因诊断

GeneDiagnosis第三页，共四十七页，2022年，8月28日

一、基因诊断的概念、内容和特点定义:

利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。前提条件：已明确疾病表型与基因型的关系。第四页，共四十七页，2022年，8月28日基因诊断的基本内容检测个体基因序列特征基因突变分析测定基因拷贝数基因表达产物分析测定是否存在外源基因第五页，共四十七页，2022年，8月28日

特点:1.以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，针对性强。2.分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故具有很高的特异性。3.由于分子杂交和聚合酶链反应（PCR）技术都具有放大效应，故诊断灵敏度很高。4.适用性强，诊断范围广。5.检测外源基因时，可以检测出潜伏的病原体。第六页，共四十七页，2022年，8月28日基因变异致病类型内源基因的变异由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致疾病。外源基因的入侵如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病。第七页，共四十七页，2022年，8月28日二、基因诊断常用技术方法限制性内切酶谱分析法DNA限制性长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP)分析等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO)（一）核酸分子杂交技术第八页，共四十七页，2022年，8月28日×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析第九页，共四十七页，2022年，8月28日+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析第十页，共四十七页，2022年，8月28日

在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异，中性变异导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不的片段，称为限制性片段长度多态性。在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可利用这一多态性片段作为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。

DNA限制性片段长度多态性（RFLP）第十一页，共四十七页，2022年，8月28日RLFP分析法第十二页，共四十七页，2022年，8月28日第十三页，共四十七页，2022年，8月28日（二）聚合酶链反应(PCR)PCR/单链构象多态性分析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。

第十四页，共四十七页，2022年，8月28日正常人纯合突变杂合突变Leber病患者PCR/SSCP分析+﹣第十五页，共四十七页，2022年，8月28日PCR/等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide，ASO)第十六页，共四十七页，2022年，8月28日（三）基因测序即测定DNA序列的技术。分离患者的有关基因，测定出碱基排列顺序，找出其变异所在，是最确切的基因检测方法。目前用于测序的技术主要有Sanger等发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert发明的化学降解法。

第十七页，共四十七页，2022年，8月28日（四）基因芯片

基因芯片(genechip)（又称DNA芯片、生物芯片）通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。

应用领域:基因表达谱分析、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等。

第十八页，共四十七页，2022年，8月28日三、基因诊断的应用遗传性疾病肿瘤感染性疾病，传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定第十九页，共四十七页，2022年，8月28日第二节

基因治疗

GeneTherapy第二十页，共四十七页，2022年，8月28日定义早期是指将外源正常基因导入靶细胞，整合入细胞基因组，纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗的目的一种治疗方法。目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。通过基因水平的操作而治疗疾病的方法。

一、基因治疗的概念第二十一页，共四十七页，2022年，8月28日1、基因修正（genecorrection）2、基因替代（置换）（genereplacement）3、基因增强（补偿）（geneaugmentation）4、基因抑制（geneconstraint）和/或

基因失活（geneinactivation）5、免疫基因治疗6、活化前体药物基因（自杀基因）治疗7、耐药基因治疗二、基因治疗的策略第二十二页，共四十七页，2022年，8月28日三、基因治疗的种类1、生殖细胞（germcell）基因治疗理论上将正常细胞基因转移到患者的生殖细胞（精细胞，卵细胞早期胚胎）使其发育成正常个体。这是理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中播散。2、体细胞（somaticcell）基因治疗是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。第二十三页，共四十七页，2022年，8月28日

四、基因治疗方式一、体内疗法（invivo、一步法）将携带有治疗基因的载体直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的组织并进行表达。二、体外疗法（exvivo、二步法）先把待接收基因的靶细胞从体内取出，将携带有治疗作用的载体导入培养细胞内，筛选、增殖，再回输体内有关组织中。第二十四页，共四十七页，2022年，8月28日目的基因+载体↓重组DNA↓受体细胞↓外源基因表达的筛选↓回输体内五、基因治疗的基本程序第二十五页，共四十七页，2022年，8月28日1、为致病基因2、遗传分子机制清楚3、该基因已被克隆，一级结构和表达调控机制清楚4、可在体外操作，而且安全有效5、转移基因能完整地、稳定地整合，并能适时适量表达（一）目的基因的选择原则第二十六页，共四十七页，2022年，8月28日

1、基因组DNA文库

2、cDNA（complementaryDNA）

3、人工合成基因片段

4、PCR扩增

目的基因的来源第二十七页，共四十七页，2022年，8月28日（二）受体细胞的选择原则1、最好选择组织特异性细胞2、容易取出3、具有较长的寿命4、离体细胞能高效导入目的基因5、经体外操作后能存活并安全回输常用的的受体细胞：

淋巴细胞、造血干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞、呼吸道上皮细胞、肿瘤细胞。第二十八页，共四十七页，2022年，8月28日（三）载体的选择和外源基因的导入病毒载体

RNA病毒载体（逆转录病毒）

DNA病毒：常用的有腺病毒、疱疹病毒、

SV40病毒、巨细胞病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒等非病毒载体

质粒、脂质体、受体介导的蛋白第二十九页，共四十七页，2022年，8月28日

目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感染细胞后，其基因组RNA经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统，适用于介导基因转移。逆转录病毒（retrovirus）第三十页，共四十七页，2022年，8月28日第三十一页，共四十七页，2022年，8月28日第三十二页，共四十七页，2022年，8月28日第三十三页，共四十七页，2022年，8月28日第三十四页，共四十七页，2022年，8月28日1、主要来自莫洛尼氏小鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus，MoMLV）其中三个结构基因（gag、pol、env）被删除2、标记基因（markergene）插入空缺，供阳性选择用。如：新霉素抗性基因（neomycinresistantgene），该基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPTⅡ），能对抗新霉素（G418）。3、有目的基因的插入位点逆转录病毒载体的构建第三十五页，共四十七页，2022年，8月28日逆转录病毒载体的优点1.可插入足够长的外源DNA（7KB）2.基因转移效率高，几达100%3.重组体可整合入宿主染色体，并稳定表达和传代4.宿主范围广、比较安全缺点1.只能整合入分裂活跃的细胞2.靶细胞表面需要有特殊的受体3.必须使用带有“辅助病毒”的包装细胞系4.病毒滴度低第三十六页，共四十七页，2022年，8月28日包装细胞：一种细胞，重组逆转录病毒载体只能在其中包装成没有感染能力的病毒颗粒，但能从中释放出去，这种细胞即包装细胞。1.多数由各种辅助病毒转染小鼠成纤维细胞系NTH3T3构成。2.辅助病毒由MoMLV切除了病毒5’端LTR至Gag起始密码之间包装信号ψ等序列，虽能产生病毒蛋白但不能进行包装。3.导入的逆转录病毒载体转录出的RNA可以利用辅助病毒产生的病毒蛋白包装成假病毒颗粒。包装细胞系第三十七页，共四十七页，2022年，8月28日第三十八页，共四十七页，2022年，8月28日（四）外源基因表达的筛选

在较多的表达载体中都有neor标记基因存在，若向培养基中加入药物G418，未被转化的细胞不存在neor标记基因，细胞不能存活，最后只有转化细胞存活下来。（五）回输体内第三十九页，共四十七页，2022年，8月28日1.选择合适的疾病：单基因遗传病2.具备该病分子缺陷的知识3.有目的基因的克隆4.克隆基因的有效表达5.克隆基因的有效调节6.可利用的动物模型遗传病基因治疗的必要条件四、基因治疗的应用（一）遗传病的基因治疗第四十页，共四十七页，2022年，8月28日基因治疗的部分对象1.严重联合免疫缺陷症（腺苷脱氨酶ADA缺乏）2.囊性纤维变性3.Gaucher病Ⅰ型（葡糖脑苷脂酶缺陷）4.苯丙酮酸尿症（苯丙氨酸羟化酶缺陷）5.血友病B（凝血Ⅸ因子缺陷）6.家族性高胆固醇血症7.地中海贫血第四十一页，共四十七页，2022年，8月28日1.宿主的修饰：保护分裂旺盛的正常组织，如造血干细胞：导入二氢叶酸还原酶基因，获得对氨甲蝶呤的抗性2.增强肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）活性：

如将肿瘤坏死因子（TNF）基因导入TIL。这是目前肿瘤基因治疗最常用的方法。3.肿瘤细胞的修饰（二）肿瘤的基因治疗第四十二页，共四十七页，2022年，8月28日如：自杀基因+病毒载体

转染重组载体

药物前体(无毒)Gene→酶→↓药物复合物(有毒)

细胞死亡第四十三页，共四十七页，2022年，8月28日例如：单纯疱疹病毒哺乳动物细胞

HSVGene-TK

（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）

Gene—TK

GCV（胸苷类似物）