基因工程的基本步骤1

基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定基因:有遗传效应的DNA片段基因的分布,成分,结构,功能与DNA一致染色体基因思考：什么是基因?

基因与ＤＮＡ的关系基因与染色体的关系

回忆旧知识：基因的基本功能是什么？1、通过复制，在后代的传种接代中传递遗传信息2、在后代的个体发育过程中，使遗传信息得以表达，控制生物的性状

DNA（基因）的基本功能DNA中碱基对(或脱氧核苷酸)的排列顺序时间场所过程模板原料能量，酶产物特点有丝分裂间期或减数分裂间期主要在细胞核，少数在线粒体、叶绿体；原核细胞的拟核区DNA分子两条单链（称为母链）四种游离的脱氧核苷酸ATP；DNA解旋酶、聚合酶等子代DNA分子(与亲代一模一样)边解旋边复制、半保留复制；

一.ＤＮＡ的复制解旋合成复旋有的是多起点复制转录：在细胞核内，以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对的原则合成RNA的过程。（一）——转录二.基因的表达:基因指导蛋白质的合成

TCATGTTTAAGT

AC

AA

A

T

DNA的平面结构图AG

T

AC

AA

A

T

AGCUGACGGUUUDNA单链游离的核糖核苷酸以DNA的一条链为模板合成RNA

RNA聚合酶AG

T

AC

AA

A

T

AGCUGACGGUUU

DNA与RNA的碱基互补配对：A—U；Ｇ—C；C—G；T—ADNA单链AGT

AC

AA

A

T

AGCGACGGUUUU

组成

RNA的核糖核苷酸一个个连接起来DNA单链AGT

AC

AA

A

T

AGCGACGGUUUU

组成

RNA的核糖核苷酸一个个连接起来DNA单链AG

T

AC

AA

A

T

GCGACGGUUUUA

组成

RNA的核糖核苷酸一个个连接起来DNA单链AGT

AC

AA

A

T

GCGACGUUGUUA

组成

RNA的核糖核苷酸一个个连接起来DNA单链AG

T

AC

AA

A

T

GCGACGUGUUAU

组成

RNA的核糖核苷酸一个个连接起来DNA单链AG

T

AC

AA

A

T

GCGACGGUUAUU

组成

RNA的核糖核苷酸一个个连接起来DNA单链AG

T

AC

AA

A

T

GCGACGGUUAUUA

组成

RNA的核糖核苷酸一个个连接起来DNA单链AG

T

AC

AA

A

T

GCGCGGUUAUUAU

组成

RNA的核糖核苷酸一个个连接起来DNA单链AG

T

AC

AA

A

T

GGCGGUUAUUAUC

组成

RNA的核糖核苷酸一个个连接起来DNA单链AG

T

AC

AA

A

T

GGCGGUUAUUAUC结果:形成的

mRNA链上,具有了特定的碱基序列，即DNA上的遗传信息传递到了mRNA上mRNADNA单链AG

T

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

细胞核

核孔DNAmRNA在细胞核中合成

细胞质AG

T

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

细胞核DNAmRNA在细胞核中合成

细胞质AG

T

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

细胞核DNAmRNA在细胞核中合成

细胞质AG

T

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

细胞核DNAmRNA在细胞核中合成

细胞质AG

T

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

细胞核DNAmRNA在细胞核中合成

细胞质AGT

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

细胞核DNAmRNA在细胞核中合成

细胞质AG

T

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

细胞质

细胞核DNAmRNA在细胞核中合成基因的表达（二）——翻译密码子mRNA上决定一个氨基酸的3个相邻的碱基密码子的位置密码子的组成密码子的作用mRNA上3个相邻的碱基决定一个氨基酸mRNA怎样控制蛋白质的合成？mRNA的碱基序列()决定蛋白质的氨基酸序列密码子思考:AUU氨基酸氨基酸氨基酸tRNA:转运RNA

可以专一地识别并搬运一种氨基酸问题：氨基酸是怎样被运送到核糖体的？氨基酸氨基酸氨基酸AUAGGAGAAAGAUUAUUAUUmRNA问题：氨基酸是怎样被运送到核糖体的？AUUAUUAUU密码子和反密码子之间按照碱基互补配对原则,氨基酸正确排序密码子反密码子AUUCCUAUAGGAGAUUGUUAUAAUAUUAUUCCUCCUmRNA核糖体AUUCCUAUAGGAGAUUGUUAUAAUCCACCACCACCUAUAGGAGAUUGUUAUAAUCCAACAACAACAAUAGGAGAUUGUUAUAAUCCAACAAUAAUAAUAAUAGGAGAUUGUUAUAAUACAAUAUUAUUAUUAAUAGGAGAUUGUUAUAAUAUAUUAAUAGGAGAUUGUUAUAAUUUAAUAGGAGAUUGUUAUAAU多肽规律:决定蛋白质中的一个氨基酸,需mRNA中____至少个碱基;需DNA中___至少个碱基.DNA(双链):mRNA(单链):蛋白质:碱基氨基酸1个3个6个遗传信息遗传密码AA序列碱基外显子内含子与RNA聚合酶结合位点编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点编码区原核生物基因真核生物基因基因的结构启动子

起始密码/终止子

/终止密码存在分子：作用：DNA(基因)启动/终止转录mRNA起始/终止翻译1、人工合成2、从基因文库中获取(基因比较小，序列已知)基因文库基因组文库部分基因文库－－如：cDNA文库目的基因的获取DNA合成仪2、从基因文库中获取目的基因

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库

基因组文库部分基因文库(CDNA文库)某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体2、从基因文库中获取目的基因限制酶与运载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入部分基因文库（cDNA文库）?为什么cDNA文库中不含启动子、内含子？从基因文库获取目的基因根据目的基因的有关信息，如：基因的已知核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA；基因的表达产物蛋白质；

……1、人工合成2、从基因文库中获取3、利用PCR技术扩增(基因比较小，序列已知)基因文库基因组文库部分基因文库－－如：cDNA文库聚合酶链式反应目的基因的获取DNA合成仪3、利用PCR技术扩增目的基因

聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。循环变性退火延伸细胞内复制

PCR扩增DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物温度控制1）模板：2）原料：3）酶：DNA母链4种脱氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶等DNA增殖4）特点:半保留复制边解旋边复制(不用DNA解旋酶)半保留复制全解旋再复制复制原点+启动子+目的基因+终止子+标志基因基因表达载体的组成基因表达载体的构建---核心基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端(一)常用的受体细胞：

有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。（二）将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。将目的基因导入受体细胞---转化（三）导入方法1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法农杆菌转化法适用于双子叶植物裸子植物将目的基因导入受体细胞---转化适用于单子叶植物基因枪法胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊花粉管通道法适用于被子植物种子植物裸子植物被子植物双子叶植物单子叶植物:松、柏、杉…:花生、大豆、棉花…:水稻、小麦、玉米…双子叶植物－网状脉单子叶植物－平行脉1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵受精卵移植（三）导入方法将目的基因导入受体细胞---转化1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理增大细菌细胞壁的通透性（三）导入方法将目的基因导入受体细胞---转化四.目的基因的检测和鉴定接种实验(抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等)抗原－抗体杂交法DNA-RNA分子杂交法DNA分子杂交法受体是否具有转基因特征个体水平目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基因是否导入分子水平方法检测/鉴定对象DNA分子杂交基因探针，是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定1、化学方法人工合成2、从基因文库中获取目的基因3、利用PCR技术扩增目的基因复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、Ca2+处理法DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原—抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定巩固练习:1.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因,该抗性基因的主要作用是()A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入进行检测C.增加质粒分子的分子量D.便于与外源基因连接2.在遗传工程技术中,限制性内切酶主要用于()A.目的基因的提取和导入B.目的基因的提取和检测C.目的基因与载体的结合和导入D.目的基因的提取与载体结合BD3.在遗传工程技术中,下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得()A.人的胰岛素基因B.蚕的蚕丝蛋白基因C.芽孢杆菌的抗虫基