基因工程和章 人类基因组计划

基因工程的相关技术基因工程主要的工具酶基因克隆的主要载体重组DNA的基本步骤基因工程的应用和成果简介

第23章重组DNA技术

基因工程的概念

geneticengineering定义：又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。目的:

是生产出符合人类需要的产品或创造出稳定遗传的生物新性状。重要特征1、可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状2、某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能２３．１．１核酸的分子杂交１ＤＮＡ的变性和复性２３．１基因工程的相关技术ＤＮＡ－ＲＮＡ杂交分子２分子探针寻找特定基因２３.１.２聚合酶链式反应（ＰＣＲ）ＰＣＲ 是一种体外ＤＮＡ扩增技术．其基本原理类似于ＤＮＡ的天然复制过程．

其以拟扩增的ＤＮＡ为模板，以一对分别于５’和３’末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在ＤＮＡ聚合酶作用下，按半保留复制机制沿模板链延伸直至完成新ＤＮＡ 的合成，反复重复这一过程就使目的基因得到扩增．组成ＰＣＲ反应体系的基本成分

模板ＤＮＡ特异性引物ＤＮＡ聚合酶（耐热）

dＮＴＰs含有Ｍg２＋的缓冲液PCR反应过程

第一步：高温变性（解链）95℃

第二步：低温退火55℃

第三步：适温延伸72℃

变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链PCR反应过程聚合酶链式反应（PCR）每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得——230（1.07×109)个基因片段23.2基因工程主要的工具酶

限制性内切酶

DNA聚合酶

DNA连接酶反转录酶1、限制性内切酶－－－－DNA操作的分子手术刀限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别一小段特殊的核酸序列并将其在特定位点处切开。

Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性的工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。DNA连接酶及其连接作用

大肠杆菌DNA连接酶(黏性末端)

噬菌体T4DNA连接酶(黏性末端和平齐末端)反转录酶兼有RNA外切酶的活性23.3基因克隆的质粒载体

载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒。质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。

23.4

基因工程技术路线（1）获得目的基因和载体（2）切割、连接形成新的重组DNA分子（3）重组DNA分子导入受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传（4）对转化子筛选和鉴定（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物基因工程的操作流程获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(genelibrary)，从中调用目的基因

(2)人工合成（3）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段（4）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等

DNA分子的体外重组黏性末端连接法

同一限制性内切酶作用

DNA连接酶作用平齐末端连接法(人工接头加尾)23.4.3转化受体细胞和转化子的筛选细菌：类似于前面所讲，由质粒携带目的基因，转入相应的细菌细胞内并进行表达。图23.7和23.8基因工程的应用1.利用转基因的细菌、植物或动物生产某些蛋白质药物1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品——人胰岛素投放市场，利用重组DNA技术生产胰岛素是生物技术领域发展的一个里程碎。它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。此后，又出现了更多的基因工程产品和蛋白质药物，如人生长激素、干扰素、白细胞介素-2、粒细胞集落因子、乙肝疫苗等等。我国生产的部分基因

工程疫苗和药物2.基因工程技术在农业、畜牧业上的应用最为广泛生长快、肉质好的转基因鱼(中国)乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄3、基因工程与环境保护⑴环境监测：

基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来

利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。⑵环境污染治理：

基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。第24章人类基因组24.1人类基因组及其组成基因组:一个单倍体细胞核中、一个细胞器中、或一个病毒毒粒中所含的全部DNA（或RNA）分子的总称。基因组学：研究生物体的基因和基因组的结构组成、不稳定性、和功能的科学。分为结构基因组学和功能基因组学。结构基因组学研究基因和基因组的结构，各种遗传元件的组成物质的序列特征，基因定位和基因组的作图等。功能基因组学

在基因组水平上阐明DNA序列的功能，着重研究不同的序列结构所具有的不同功能，基因的表达与调控，基因和环境之间的相互作用。

人类基因组的DNA序列组成人类基因组有3.2×109个bp的DNA，有约4万个基因。基因及相关序列约占10%，基因外序列约占90%。见图24.124.1.2人类基因组各组成成分的基本特征1基因：断裂基因，存在大小差异和内含子数量的差异。与基因相关的序列：存在于3’非编码区的3’UTR和5’端UTR，只转录而不被翻译

启动子序列存在于转录起始位点的上游。2基因外DNA：

70-80%为单一和低拷贝形式存在；

20-30%为中度或高度重复序列。在基因组中重复出现的DNA序列。分散重复序列(这些序列以散在的形式分布在基因组中)

长分散重复序列LINE（1000bp，一万份）

短分散重复序列SINE（100-300bp，10万份）串联重复序列

1卫星DNA（重复单元100-5000kb）

2小卫星DNA（9-70bp）

3微卫星DNA(1-4bp)

24.2癌基因与恶性肿瘤肿瘤的基本特征：

正常的细胞的增殖和凋亡失控，扩张性增生的细胞群形成肿块．分类：良性肿瘤恶性肿瘤：（癌）能侵染周围组织和器官，有远端转移能力，破坏被侵染的脏器，直至机体死亡．

正常细胞与癌细胞比较癌基因和抗癌基因病毒癌基因(VirusoncogeneV-onc).1976年H.Evarmus和发现鸟类肉瘤病毒中含有致癌基因。被命名为病毒癌基因细胞癌基因或原癌基因：在正常人或动物细胞内有与V-onc同源的基因称细胞癌基因或原癌基因癌基因癌基因是正常细胞中的一些基因，是细胞生长发育所必需的。一旦这些基因在表达时间、表达部位、表达数量及表达产物结构等方面发生了异常，就可以导致细胞无限增殖并出现恶性转化。癌基因(oncogene)：是指能引起细胞恶性转化的基因。原癌基因(protooncogene)抗癌基因（antioncogene）有些基因的存在和表达使细胞不能癌变和机体不长癌，这类基因被称为抗癌基因．细胞癌变的过程是原癌基因被激活而抑癌基因失活．癌症的遗传学基础基因突变遗传物质的损伤和基因结构的改变是细胞发生恶性转化的必要前提。多次遗传改变的致癌作用

（三）人类基因组作图人类基因组计划

(HumanGenomeProject，HGP)旨在阐明人类基因组DNA长达3X109碱基对的序列，发现所有人类基因并阐明其在染色体上的位置，从而在整体上破译人类遗传信息。美国于1990年正式启动HGP，投资30亿元，计划于2005年完成人类基因组全部序列的测定。

人类基因组计划的内容

遗传图谱物理图谱转录图谱序列图谱遗传图谱（geneticmap）

又称连锁图谱（linkagemap），是表示基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离的基因组图，反映染色体上两点之间的连锁关系。遗传图谱是以细胞减数分裂时同源染色体发生交换的DNA区段为标记。遗传距离通常以基因或DNA片段在染色体交换过程中的重组频率cM来表示。物理图谱（physicalmap）

物理图谱指DNA序列上两点之间的实际距离,其目标是在基因组中每100kb设一个标志点（即“路标”）;目前最满意的是以已定位的DNA序列标记位点（sequencingtaggedsite，STS）作为“路标”，以DNA的实际长度为“图距”绘制物理图谱。物理图谱是进行DNA序列分析和基因组织结构研究的基础。转录图谱（transcriptionmap）

转录图谱又称cDNA（complementaryDNA）计划，是以表达序列标签（expressionsequencetag，EST）为标志绘制的图谱。在获得足够多的EST序列后，对这些EST片段进行染色体定位，最终绘制成一张可表达的基因图——转录图谱。有了这张转录图谱，我们就可以了解不同基因在不同的时间、不同组织的表达情况；以及正常与异常状况下基因表达的差异。来自不同组织和器官的EST可为基因的功能研究提供有价值的信息，为基因鉴定提供候选基因。序列图谱

人类基因组计划最终要测定出由3×109bp核苷酸组成的人基因组DNA的全部序列。随着全新测序技术与策略的参与，这项工作的进度大大加快，已远远超越了原定计划的时间表。目前已全部完成。（四）人类基因组计划的步伐

1990年，HGP正式启动；

1991年，人类染色体基因组数据库（GDB）建立；

1992年，低分辨率人类基因组遗传图谱发表；

1993年，对HGP的目标进行了修正；

1994年，遗传图谱比原目标提前一年完成；

1995年，最小的细菌——生殖器支原体测序完成；

1996年，真核生物酵母基因组测序完成；

1997年，大肠杆菌基因组测序完成；

1998年，秀丽线虫基因组测序完成；同年5月，

celera公司宣布加入HGP，HGP的进程走了一半；

1999年初，celera公司宣布果蝇的测序完成；

1999年9月，中国获准加入该计划，测1％的基因组，也就是3号染色体上的30Mb；

1999年12月，国际人类基因组计划联合研究小组宣布对第一条人类染色体——22号染色体测序完成；

2000年4月，中国科学家按照国际人类基因组计划的部署，完成了1%人类基因组的工作框架图；

2000年5月，人类第21号染色体的测序完成；

2000年6月26日，HGP科学家、美国总统克林顿以及celera公司负责人同时宣布人类基因组序列的“工作框架图”完成。

2001年2月，Science和Nature分别发表了经过整理、分类和排列的基因组“精细图”及初步分析结果。同年，人类第20号染色体测序完成；

2002年12月，小鼠基因组序列草图发表；

2003年1月，人类第14号染色体测序完成；

2003年4月14日，人类基因组计划宣布完成。（五）人类基因组计划的研究价值医学领域：将人类感知生命的里程提高到分子水平阶段，大大加速人们对疾病基因的鉴定；生命科学领域：阐明基因的结构与功能关系，细胞的发育、生长、分化的分子机理，疾病发生的机理等，有利于理解生物是如何进化的；促