基因诊断与基因治疗

第二十一章基因诊断与基因治疗1第一节基因诊断一、基因诊断的含义基因诊断（genediagnosis）亦称分子诊断、DNA诊断。采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。2二、基因诊断的原理及方法1基因诊断的原理

检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常

2基因诊断的方法 （1）DNA诊断 （2）RNA诊断3（1）DNA诊断

1）限制性片段长度多态性2）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（allele-specificoligonucleotideprobe,ASOprobe） 3）单链构象多态性（SSCP） 4）DNA序列分析（2）RNA诊断1）RNA印迹（Northernblot）2)RT-PCR41）限制性片段长度多态性 —基因连锁分析（1）方法原理：

待测DNA序列中的点突变导致了某一限制性内切酶识别位点的改变可引起其特异的限制性内切酶片段的大小与多少随之改变，即而通过Southern印迹杂交和限制性内切酶酶谱分析诊断出点突变。56（2）诊断原理

在人群中，个体间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。DNA多态性可以改变限制性内切酶的切割位点，产生DNA限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlenthpolymorphism,RFLP）。67

RFLP按照孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一种致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可利用这一多态性片段作为一种遗传性标志来判断家族成员或胎儿的基因组中是否携带致病基因。7889（2）应用A

sickle-cellanemia的基因诊断a.

病因血红蛋白中的β珠蛋白N端第6位氨基酸正常为谷氨酸，贫血时突变为颉氨酸。9101234561011b.检测限制性内切切酶：Sau1酶切位点：：CCTNAGG探针：标标记的β珠珠蛋白1112c.结果分析切割正常待待测血红蛋蛋白β珠蛋蛋白，DNA与探针针杂交后产产生1.1kb切割异常待待测血红蛋蛋白β珠蛋蛋白，DNA与探针针杂交后产产生1.3kb121313141415（1）原理理根据已知的的基因突变变位点的核核苷酸序列列，人工合合成相应于于突变基因因异常核核苷酸序列列的寡核苷苷酸作为杂杂交探针，，从而直接接检测和鉴鉴定突变基基因。2）等位基基因特异性性寡核苷酸酸探针杂交交法（allelespecificoligonucleotide,ASO）1516相应于突变变基因异常常相应于正常常基因核苷酸序列列的寡核苷苷核苷酸序列列的寡核苷苷杂交探针酸杂交探针针与受检者DNA进进行分子杂杂交发生杂交均可杂交与异常不不发生杂交交(突变纯和和子）（杂和子）与正常发生生杂交(正常纯和和子）161717181）病因H-ras（（化学诱导导）ras家族族K-ras编码P21蛋白N-ras（（自然然发生)ras家族族点突变好好发于12、13、61位位密码子（2）应用用——大肠癌K-ras的基因因诊断18192）检测a、PCR扩增用人工合成成的位于待待测点突变变两侧的引引物，分别别扩增含12、13、及61位点的基基因片段。。1920b、ASO分析①将扩增产物物结合在尼尼龙膜上分分别与ras原癌基基因密码子子12、13、61所有可能能引起碱基基突变的寡寡核苷酸探探针进行杂杂交；②②杂交后，膜膜经严格的的洗涤，仅仅允许完全全相配的杂杂交双链存存在；③针针结合处在在光胶片上上呈阳性斑斑点2021223）mRNA的检测测（1）原理理通过对mRNA进行行定量、检检测其剪剪接加工的的缺陷以及及外显子变变异等判断断基因能否否转录、转转录物（mRNA））是否正常常以及转录录效率的高高低。2223*mRNA不稳定可可将其转为为cDNA再用PCR技术进进行研究（（RT-PCR）2324（2）应用用视网膜母细细胞瘤：Rb基因缺缺陷Rb1基因因的mRNA全长4.7kb采用RT-PCR技术分析析外显子突突变或mRNA前体体剪接异常常。2425分析外显子子19至22间的基基因突变逆转录引物物：外显子子22反义义链序列5`-GGTACCGTGGAAGCTTACTGCAAAT-3`PCR引物物:外外显显子22正正义链序列列5`-CCATGGGACCTTCGAATGACGTTTA-3`外显子19正义链序序列5`-GAATTCGTATCTTTCTCCTGTAAGAT-3`2526用RT-PCR检测测艾滋病26三、基因诊诊断的应用用1.遗传传疾病的诊诊断产前诊断、、遗传病易易感性2感染性性疾病（1）病毒毒性感染（2）细菌菌性感染（3）寄生生虫（4）其他他273恶性肿肿瘤4法医学学中应用28（1）DNA指纹分分析（DNAfingerprinting）可变串联重重复序列小卫星DNA（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）29（2）短串串联重复（（shorttandemrepeat,STR）多态性性分析微卫星DNASTR—PCR30第二节基基因治疗的的基本概念念和基本策略一基基因治疗（（genetherapy）的概念念1、背景与与历史疾病的分子子生物学了了解新技术新方方法（特别别是重组DNA）的的迅速发展展311989年年5月28日

第一一个基因标标记计划（TIL-NeoR）1990年年9月11日第第一个基因因治疗计划划（ADA-SCID）321995年年NIH组组织Orkin、、Motoksy对头头5年基因因治疗评估估3点建议：：发展载体技术术疾病的分子机机制动物模型成立3个国家家实验室2000年2月532个计划，3400余个个病人33病种：恶性肿肿瘤62.2%遗传性疾病13.3%AIDS6.8%心血管疾病6.8%其他1.3%342、定义基因角度：正正常或有功功能的基因置置换或增补缺陷陷基因。治疗角度：新新的遗传物物转移到某个个体获治疗效果果。353、方式基因矫正和置置换:同源源重组基因增补:ADA、、血友病基因封闭:myc基因因过度表达达，反义抑抑制活化前体药物物基因治疗：：36单纯疱疹病毒毒胸腺嘧啶激激酶基因导入肿瘤细胞合成HSV-TK无毒性的抗病病毒有有毒性的抗病病毒药物（GCV）药药物（GCV三磷磷酸）细胞死亡374、导入方式式exvivo基基因转移移invivo基基因转移移38第三节基因因治疗的条件件1、目的基因的种种类：细胞因子、缺缺陷基因、抑抑癌基因、受体基因391、目的基因的获获得方法1）真核基因组DNA文库中中目目的基基因的克隆2）cDNA文库库中目的基因因的克克隆3）人工合成基因因片段4）PCR法筛选选扩增目的基基因401、外源基因的要要求1）含信号肽的cDNA，序序列正正确确

2））必要的调控元元件（顺式作作用元件件启动子子、增强子子、静止子子）413）外源基因进入入细胞核转录录，再再转移至细细胞浆，间隔隔序列列（内含含子），剪接接信号（（SA,SD）PolyA信号，核核内内转录因子子4）翻译的起始密密码子、终止止密密码子、内核核糖体进入位位点点（IRES）元件5）外源基因的丢丢失、失活、、甲基化化424、基因治疗疗的靶细胞（（targetcell）1）生殖细胞全世界受严格格控制2）体细细胞选择的标准：：A、容易取出和移移植B、容易体外培养养C、目的基因高效效导入D、细胞寿命长43常用靶细胞；；自体、同同种异异体、异异种、、淋淋巴、骨骨髓、皮肤、、肝、肌、肿肿瘤细胞等4445基因导入的方方式：exvivo——体外将基因导导入targetcell,然后将将此修饰过的的细胞胞回输给病人人。Invivo——外源基因直接接导入体内内有关的的组织器官。。463、基因导导入（转移））的工具与方方法。将外源基因或或DNA片断断导入宿主细细胞进行扩增增或表达，需需要有一个能能在该宿主细细胞进行复制制和表达的载载体（vector）来来携带。前者者与后者在体体外构成重组组DNA分子子，然后导入入宿主细胞。471）非病毒方方法4849（一）磷酸钙钙转染技术磷酸钙--DNA导入细胞吞噬体转运细胞器瞬时稳稳定外源基因存在在外外源源基因非特异异于染色体DNA外与与宿主主染色体DNA重组12小时内表表达持续约3-4天降解稳稳定定转化细胞株株50（二）DEAE-葡葡聚糖转染技技术（略）51（三）脂质体体转染法（（20%）聚阳离子脂质质体-DNA脂质体DNA阳离子复合合物负电荷的细胞胞膜吸收此复复合物（融合吸收））优点：简便、、低毒性、无无免疫原性、、无病毒产生、、化学成分已已知可大量商业供应应缺点：转染效效率低，短暂暂表达52（四）电穿孔孔转染技术靶细胞（悬浮浮态）+外源源目的DNA电穿孔仪高高压压电脉冲靶细胞膜发生生瞬时可逆性性破裂形形成微孔外源目的DNA进入靶细细胞53（五）基因枪枪技术电子发射装置置或高压气流流金或钨颗粒包包裹外源目的的DNA形成成“子弹”打入靶细胞54上述物理、化化学方法转移移基因的缺缺点：1）转移效率低，，多应用于实实验验研研究2）维持时间短2、病毒方方法55在以基因治疗疗为目的的载载体系统中，，以病毒载体体最为常用，，其优点：1）易于改造与操操作2）转移效率高3）较高的靶靶细胞特异性性56病毒载体：逆转录病毒(retrovirus)载体————用于具有分裂裂功能的细细胞中进行行基因转移与与表达57腺病毒(adenovirus)、腺相关病病毒(adeno-associated-virus—————用于非增殖性性细胞中进行行基因转移与与表达58（六）逆转录录病毒载体1、逆转录病病毒的结构由2条相同的的38S单链链RNA组成成2、逆转录病毒的的生活周期596061感染宿主细胞胞病毒基因组的的整和原病毒DNA的转录与翻翻译逆转录病毒颗颗粒的释放623、原病毒DNA的结构构特点63644、逆转录病病毒载体的构构建65665、包装细胞胞系的构建1）没有包装装细胞，逆转转录病毒载体体就不能装配配成假病毒颗粒感染染靶细胞，完完成外源源基因的高效效转移672）去除除莫洛尼氏小小鼠5’端含含有包装信号号ψ一段序列列辅助病毒整和NIH3T3染色体形成包装细胞系转录编码病毒毒结构基因携携带带外源基因的的逆不能包装成病病毒颗粒转转录病病毒载体（含含有包装信号号）导入该细细胞系提供病病毒结结构基因提提供包包装装信号包装成仅含有有外源目的基基因假病毒686、逆转录病病毒-包装细细胞系的特特点1）感染增殖分裂裂的细胞2）转移效率高3）有效整和、传传代4）宿主范围广（七）腺病毒毒载体1、腺病毒载载体的结构6970713、腺病毒载载体的特点1）可感染非增殖殖分裂的细胞胞2）易于培养与储储存3）非整和4）可致免疫反应应（八）质粒DNA直接接注射72基因治疗的基基本过程73靶基因+载体体————重重组DNA分分子——————靶细胞—————病人人74举例：细胞因子修饰饰肿瘤细胞降降低低其致瘤性性提高其免疫疫原性751、靶基因：细细胞因子（αα-TNF,IL-2,γ-IFN,等等）2载体体：逆转转录病毒ψLTRgagpolenvLTR76逆转录病毒载载体PLN系系列：ψLTRNEOLTR773、包装细细胞：PA317,包包装为为病毒4、感染靶靶细胞5、在靶细细胞中表达基基因产物78基因治疗的安安全性问题:2次事故靶向性、效、、基因整合位位点、表达调控控79基因敲除（knockout）与与基因添加（knockin）遗传工程生物物中，一个正正常基因可被被几种方式所改变方法1：正常基因完全全被基因的突突变拷贝所替替换可以在没有正正常基因的干干扰下提供供突变基因活性的信信息80方法2正正常常基因彻底失失活应用于获得正正常基因在整整体生物中的可能功功能的信息方法3一一个个突变基因加加入到基因组组最易进行的遗遗传工程8182转基因动物的的概念用实验方法把把外源基因导导入动物的受受精卵，再将将这一受精卵卵接种到借腹腹怀孕的寄养养雌性动物（（fostermother）的的子宫内，使使之发育繁殖殖，这时外源源基因与动物物本身的基因因组整合，外外源基因就能能随细胞分裂裂而增殖，再再体内表达，，并传给下一一代，这样生生育的动物称称为转基因动物8384小鼠基因置换换过程的总结结8586动物药厂的基基本概念87889、静静夜夜四四无无邻邻，，荒荒居居旧旧业业贫贫。。。。1月月-231月月-23Sunday,January1,202310、雨雨中中黄黄叶叶树树，，灯灯下下白白头头人人。。。。13:54:0713:54:0713:541/1/20231:54:07PM11、以我独沈久久，愧君相见见频。。1月-2313:54:0713:54Jan-2301-Jan-2312、故故人人江江海海别别，，几几度度隔隔山山川川。。。。13:54:0713:54:0713:54Sunday,January1,202313、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。1月-231月-2313:54:0713:54:07January1,202314、他乡生生白发，，旧国见见青山。。。01一一月20231:54:07下午午13:54:071月-2315、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。。一月月231:54下下午午1月月-2313:54January1,202316、行行动动出出成成果果，，工工作作出出财财富富。。。。2023/1/113:54:0713:54:0701January202317、做前，，能够环环视四周周；做时时，你只只能或者者最好沿沿着以脚脚为起点点的射线线向前。。。1:54:07下午午1:54下午午13:54:071月-239、没有失败败，只有暂暂时停止成成功！。1月-231月-23Sunday,January1,202310、很多事情努努力了未必有有结果，但是是不努力却什什么改变也没没有。。13:54:0713:54:0713:541/1/20231:54:08PM11、成成功功就就是是日日复复一一日日那那一一点点点点小小小小努努力力的的积积累累。。。。1月月-2313:54:0813:54Jan-2301-Jan-2312、世间成事事，不求其其绝对圆满满，留一份份不足，可可得无限完完美。。13:54:0813:54:0813:54Sunday,January1,202313、不知香积寺寺，数里入云云峰。。1月-231月-2313:54:0813:54:08January1,202314、意志坚强的的人能把世界界放在手中像像泥块一样任任意揉捏。01一月20231:54:08下午13:54:081月-2315、楚塞三三湘接，，荆门九九派通。。。。一月231:54下午午1月-2313:54January1,202316、少年十十五二十十时，步步行夺得得胡马骑骑。。2023/1/113:54:0813:54:0801January202317、空山新雨后后，天气晚来来秋。。1:54:08下午1:54下下午13:54:081月-239、杨柳柳散和和风，，青山山澹吾吾虑。。。1月-231月-23Sunday,January1,2