组织培养第二章植物组织培养基本操作

第二章植物组织培养基本操作宜职院08.9

目的与要求

了解植物组织培养的培养基种类、成分及其特点，学习植物组织培养基本操作，了解离体培养环境条件，以及炼苗移栽基本方法。具有植物组织培养基本操作程序的认知。能够识别各类培养基特点，熟悉MS培养基成分；具有制作培养基能力，具有选择外植体、表面灭菌、无菌接种等基本能力；具有植物组织培养条件控制基本能力；有进行组培苗驯化练苗的基本能力。第一节培养基成分、种类及特点第二节培养基的制备第三节外植体无菌接种第四节外植体培养第五节试管苗的驯化与移栽组织培养步骤图（1）准备阶段

查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制定出切实可行的培养方案。根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。（2）外植体的选择与消毒

选择合适的部位作为外植体，采回后经过处理，然后进行消毒处理。将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，或剥离出茎尖、挑出花药，接种到启动培养基上。（3）启动培养

接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。（4）增殖培养

分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的增殖培养基经反复多次切割转接。当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的还要进行病毒检测。

（5）生根培养刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降低或不加细胞分裂素浓度，提高生长素浓度，促进芽苗生根，提高其健壮度。（6）炼苗移栽选择生长健壮，有3～5条根的生根苗进行炼苗，移栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫。当苗完全成活后，再移向大田。拟定培养方案外植体预处理外植体无菌接种启动培养分化出芽、胚状体或原球茎继代增殖培养生根培养炼苗移栽成活供生产使用植物组织培养的一般程序

培养基配制灭菌第一节

培养基成分、种类及特点植物生长必需16种基本元素：N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。离体培养条件下，各元素主要从培养基中获得：H和O来源于水，C来源于添加的糖类，其它矿质元素来源于组成培养基的无机盐。培养基是根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的人工制作的营养物质。一、培养基的成分培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调节剂三大基本组成成分。1、无机盐类

功能离体组织生长发育的基本成分根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两类：

微量元素—植物所需元素的浓度小于10-5～10-7mol/L，Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。除C、H、O外，其它矿质元素通常以离子态吸收N-硝态氮和铵态氮

2、有有机化化合物物培养基基中只只有无无机盐盐叫做做基本培培养基基，为使培培养物物更好好的生生长，，还需需添加加有机机成分分，常常用有有糖类类、维维生素素、醇醇类、、嘌呤呤、氨氨基酸酸等。。⑴糖类类功能离体培培养物物生长长与发发育不不可缺缺少的的有机机成分分，即即作为为碳源源，又又维持持培养养基的的渗透透压在MPa。多使用用蔗糖糖，试试管苗苗生长长与繁繁殖浓浓度2-3%，，幼胚胚培养养4-6%，某某些特特殊培培养中中用8-10%。细胞和和原生生质体体培养养还用用麦芽芽糖、、葡萄萄糖、、果糖糖。⑵维生生素类类功能参与酶酶的形形成、、蛋白白质、、脂肪肪代谢谢，明明显的的促进进离体体培养养物的的生长长。盐酸硫硫胺素素-VB1、盐酸吡吡哆醇醇-VB6、烟酸-Vpp、生物素素-VH、、维生素素C-Vc。。⑶肌醇功能促进糖糖的转转化、、维生生素和和激素素的利利用，，对胚胚状体体和芽芽的形形成有有良好好影响响。用量一一般50-100mg/L。。⑷腺嘌嘌呤合成各各种细细胞分分裂素素的前前体物物质之之一，，利于于细胞胞分裂裂，促促进芽芽的形形成和和生长长。⑸氨基基酸蛋白质质的成成分，，是有有机氮氮化合合物，，常用用甘氨氨酸和和多种种氨基基酸混混合物物如水水解酪酪蛋白白、水水解乳乳蛋白白。⑹其它它复合合成分分成分尚尚不清清楚的的天然然提取取物，，如椰椰乳、、香蕉蕉汁、、酵母母提取取液、、番茄茄汁、、麦芽芽糖等等。3、生生长调调节物物质⑴生长长素类类功能促进细细胞脱脱分化化和细细胞伸伸长，，诱导导愈伤伤组织织产生生生长素素与细细胞分分裂素素协调调作用用，在在离体体培养养中，，生长长素促促进根根的形形成，，抑制制芽的的形成成。液体培养养中利于于体细胞胞胚胎发发生。常用IAA、、IBA、NAA、2,4-D。IBA促进生根根细胞分裂裂素的生生理效应应⑵细胞分分裂素类类功能促进细胞胞分裂和和扩大，，调节器器官分化化，延缓缓组织衰衰老，增增强蛋白白质合成成。离体体培养中中，促进进不定芽芽的发生生，与生生长素协协调作用用可有效效控制培培养物的的生长与与分化。。常用6-BA、ZT、KT、2iP。。植株的形形态建成成是CTK和IAA的比值调调控的CTK/IAA高，诱导导愈伤组组织形成成芽CTK/IAA低，诱导导愈伤组组织形成成根烟草在不不同细胞胞分裂素素与生长长素浓度度下的生生理效应应⑶赤霉素素类功能促进细胞胞伸长生生长、诱诱导花芽芽形成、、打破种种子休眠眠以及诱诱导单性性结实等等。与生长素素协调作作用对形形成层分分化有影影响，刺刺激体细细胞胚进进一步发发育成植植株。有20多多种，目目前主要要是赤霉霉酸GA3。4、水离体培养养中，既既是培养养基营养养成分的的溶剂，，又是培培养基的的重要组组成部分分，占培培养基成成分的95%。。原生质体体培养、、细胞培培养及分分生组织织培养一一般应用用双蒸水水或超纯纯水大批量快快速繁殖殖培养，，可用一一般蒸馏馏水或纯纯净水。。5、其它它附加成成分⑴琼脂功能来自海藻藻的多糖糖类物质质，组织织培养中中最常用用作凝固固剂，是是最方便便、最好好的凝固固剂和支支持物。。常用量0.6%-1.0%，，不是培培养基必必需成分分。卡拉胶海藻提取取物，含含杂质少少纯度更更高，凝凝固后培培养基透透明，利利于材料料观察。。⑵活性炭炭功能常用的吸吸附剂，，某些培培养类型型中，可可以吸附附培养过过程中产产生的一一些有毒毒物质（（酚类物物质），，有利于于培养物物的生长长。常用用浓度1～5mg/L左右其吸附作作用选择择性较差差，使用用应慎重重。常受受温度影影响，低低温吸附附效果好好，高温温吸附能能力降低低甚至解解吸附。。⑶抗生素素培养基中中添加抗抗生素可可防止菌菌类污染染，常用用的抗生生素有青青霉素、、链霉素素、庆大大霉素等等，用量量一般为为5～20mg/L。大部分分抗生素素需要过过滤除菌菌。⑷抗氧化化物抗酚类氧氧化常用用的药剂剂有半胱胱氨酸、、聚乙烯烯吡咯烷烷酮（PVP）及抗坏坏血酸（（Vc），可用用50～200mg／L的浓度洗洗涤刚切切割的外外植体伤伤口表面面，或过过滤除菌菌后加入入固体培培养基的的表层。。二、常用用培养基基的种类类、配方方及特点点（一）培培养基种种类1、根据据态相分分：固体培养养基-加凝固固剂的培培养基液体培养养基-不加凝凝固剂的的培养基基。2、根据培养养过程分：初代培养基-初次接种外外植体的培养养基。继代培培养基基-接种种初代代培养养之后后培养养物的的培养基基。3、根据据作用用分：：诱导培养基基-诱诱导外外植体体启动动生长长增殖培养基基-诱诱导离离体培培养苗苗扩大大繁殖殖。生根培养基基-诱诱导离离体培培养苗苗生根根4、根根据营营养水水平分分：基本培养基基-包包含无无机盐盐等基基本营营养成成分。。完全培养基基-包包含使使植物物离体体生长长全面面营养养。（二））几种种常用用培养养基细胞工工程常常用的的基本本培养养基有有：MS、、MT、、White、、Nitsch、、Blaydes、、N6、B5、NT、、SH、、Miller、、Heller等。。（三三））几几种种常常见见培培养养基基的的特特点点1、富盐盐平衡培培养基无机盐浓浓度高，，元素比比例适当当，离子子平衡好好，具有有较强的的缓冲性性，培养养中维持持较好的的稳定性性，含高高量氮、、钾，营营养丰富富，元素素种类齐齐全，MS培养基使使用最广广泛。2、低盐盐培养基基无机盐浓浓度低，，有机成成分含量量低，多多数作为为生根培培养基、、胚胎培培养使用用，常用用White培养基。。3、高硝硝态盐培培养基较低铵盐盐，高硝硝酸盐和和盐酸硫硫胺素B5培养基适适合双子子叶植物物特别是是木本植植物的生生长。N6培养基为为水稻等等禾谷类类花药培培养设计计，KNO3和（NH4）2SO4含量高,不含钼钼。SH培养基(NH4)H2PO4代替（NH4）2SO4,矿质浓度度较高，，多数单单子叶和和双子叶叶植物上上使用较较好。4、中盐盐培养基基大量元素素无机盐盐为MS的1/2，微量量元素种种类减少少含量增增高，无无肌醇维维生素种种类多，，增加生生物素、、叶酸，，有H、Hitsch、Miller、、Blaydes等培养基基，适用用于特殊殊细胞培培养。第二节培培养基基的制备备制作一升升培养基基所需药药品20多种，，为节省省时间和和配制的的准确，，需将各各种药品品浓缩成成一定倍倍数，并并且混合合成一定定母液，，进行保保存。制制作培养养基时根根据需求求制培养养基数量量取用母母液。一、培养养基母液液的配制制（一）营营养成分分的配制制根据药品品性质将将母液配配制成以以下四类类：1、大量量元素可以混在在一起配配制成10—20倍液液，硫酸酸镁和氯氯化钙Ca２+和Mg2+会与磷酸酸盐混合合，产生生不溶性性沉淀，，要分别别单独配配制Ca２+与PO4-一起混合合易沉淀淀，定容容后消失失。2、微量量元素可配成100——200倍混合合母液，，KI可单独配配。3、铁盐盐硫酸亚铁铁和EDTA钠盐易沉沉淀，需需单独配配制，配配成100—200倍倍鳌合剂剂不易沉沉淀。4、有机机化合物物维生素、、肌醇、、氨基酸酸等一起起配成100或或200倍液，，也可分分别配制制。（二）植植物生长长调节物物质的配配制植物生长长调节物物质分别别配成母母液储于于冰箱，，浓度一一般为0.5－－1mg/ml。1、IAA、NAA：：先用少量量95%酒精使使之充分分溶解。。2、2,4－D：可用少量量0.1mol/L的NaOH溶液充分分溶解，，再缓缓缓加蒸馏馏水定容容至需要要的体积积。3、KT和BA等细胞分裂裂素类：：先用少量量0.1mol/L的HCl溶解，再再用蒸馏馏水定容容至需要要的体积积。（三）药品用量量的计算：：配制母液液时药品品用量(mg)=配方用量(mg)×浓缩倍数×制制备容量（L）二、培养基的的制作（一）母液取取用量的计算算制备培养基时时母液取用量量（ml）=1000÷浓缩倍数×制制备培养基数数量（L）（二）培养基基制作程序1、按大量元元素、微量元元素、铁盐、、有机成分顺顺序将母液取出，混合。。2、适量蒸馏馏水放入加热热容器，蒸馏馏水应少于所所制培养基数数量，约终体体积的2/3-3/4，，接通电源加加热。3、向加热容容器中加入称称量好的琼脂（0.6-0.8%），，搅拌加热，，至完全溶化化。培养基制作程程序图4、琼脂熬化化后，称取相相应量的蔗糖（2-3%）），加入加热热容器中至溶溶解。5、将母液混混合液加入到到加热容器中中，搅拌混匀匀。6、蒸馏水定容至所需体积。。7、测试培养养基溶液的PH值(5.8-6.0)，，过高滴加0.1mol/L的HCL调整，过低滴滴加0.1mol/L的NaOH调整。8、迅速分装到培养瓶中，，备用。培养基是离体体培养物赖以以生存和生长长的人工环境境的重要组成成部分，常用用的培养基依依据其物理状状态的不同分分为固态培养养基和液态培培养基。固态培养基一一般使用琼脂脂为凝固剂，，也有使用卡卡拉胶或魔芋芋粉为凝固剂剂的。液态培养基不不使用凝固剂剂，但需要在在容器中置入入适当的支撑撑物，试管为为培养容器的的支撑物可用用滤纸桥，底底面积较大的的培养容器，，支撑物可选选用脱脂棉等等。固体培养基三、培养基及及培养器械的的灭菌制备好的培养养基如果带菌菌，会导致植植物离体培养养失败，因而而还要对培养养基进行灭菌菌处理。（一）高压蒸蒸汽灭菌培养基的灭菌菌一般采用湿湿热灭菌法：：1、培养瓶及及培养器械放放入高压灭菌菌锅。2、灭菌锅加加水至淹没电电热丝。3、封闭高压压灭菌锅各出出气口。4、接通电源源加压至49kPa（0.05MPa）5、打开排气阀，，排冷气至压力0kPa。6、继续加压至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃））7、压力至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃））时，稳压在此压力15-20min。8、关闭电源自然然冷却至压力力为0kPa。9、取出培养基和和器械冷却，，贮存于30℃以下室内内。（二）干热灭灭菌培养瓶、三角角瓶、试管等等玻璃器皿及及接种器械，，可以进行干干热灭菌。即将洗涤干干净的玻璃璃器皿放到到烘箱中，，在150℃温度下下，干热灭灭菌1小时时，或120℃下灭灭菌2小时时。灭菌完毕冷冷却后取出出器械贮存存。贮存室要保保持无菌、、干燥、以以免造成培培养基的二二次污染。。灭菌后的培培养基一般般应在2周周内使用，，时间过长长易造成潜潜在的污染染。培养基灭菌菌后如果出出现过多沉沉淀或琼脂脂不凝固等等现象，该该培养基不不能继续使使用，应查查明原因重重新配制。。第三节外外植体无无菌接种一般来说，，无论何种种类型的细细胞工程技技术，起始始阶段均涉涉及外植体体取材、灭灭菌、接种种与培养等等基本过程程。一、植物材材料的培养养与取材外植体—是指用于于离体培养养的活的植植物组织、、器官等材材料，是植植物离体培培养的基础础材料。1、外植体体的来源-生长在自自然环境下下的植物-有目的地地培育在温温室控制条条件下生长长的植物-无菌环境境下已经过过离体培养养的植物自然环境中中生长的植植株，一般般带有微生生物，甚至至与某些微微生物具有有寄生关系系，使植株株具有内生菌。取自这些些植物的外外植体，在在培养过程程中会有微微生物滋生生，从而影影响培养效效果。自然环境境生长植植株温室控制制条件下下生长植植株已离体培培养植株株多数情况况下，应应尽量使使用温室室或人工工气候室室控制培培养的植植物材料料作为外外植体来来源，减减少培养养过程中中的微生生物感染染概率。。同时，，生长在在控制条条件下的的植物可可以保持持培养料料间的一一致性，，提高实实验的可可重复性性，也便便于培养养技术的的规范。。某些多年年生植物物或特殊殊材料，，必须取取自自然然生长的的植物，，就需要要尽可能能避免使使用那些些生长过过于潮湿湿和不洁洁净环境境中的植植物。对对于培养养过程中中可能出出现内生生菌污染染的材料料，应尽尽量取生生长旺盛盛期的生生长点部部位作为为起始培培养的材材料。2、供体植株株的管理取自室外的外外植体材料，，供体植株的的管理十分重重要，这与外外植体培养时时的污染率密密切相关。植植株管理中应应注意：⑴避免昆虫危危害许多多昆虫如蚜虫虫、螨类和飞飞虱是许多植植物病虫害的的传播媒介，，会引起植物物组织的潜在在感染。⑵注意防病尤尤其是真真菌和细菌病病害的侵染，，取自感病植植株的外植体体，在培养中中的污染率远远远高于来自自健康植株的的外植体，必必要时需使用用化学药剂防防治病害。⑶控制湿度给给供体植植株浇水时应应从根部给水水，避免从上上部浇水，以以免上部形成成易于病原侵侵染的湿度环环境；尽可能能降低温室湿湿度；取材前前尽可能保持持植株干爽。。1、材料取材材⑴材料选择培养材料应选选择有代表性性的主要植物物、选择性状状优良的种质质或特殊的基基因型。快速繁殖时应应在植株生长长的最适时期期取材，花药药培养应在花花粉发育到单单核期取材。。选取材料的大cm之间。胚胎培培养或脱毒在在0.5cm以下。材料太太大易污染，，材料太小难难于成活。⑵采收从生长健壮的的无病虫害的的植株上选取取发育正常的的器官和组织织。最好采用用茎尖，后代代性状较稳定定，携带细菌菌较少。二、预处理与与表面灭菌1、预处理先对植物材料料进行修剪整整理，去掉不不需要部分，，将准备使用用的植物材料料（外植体））在流水中冲冲洗20-60分钟，备备用。如特别别不洁的外植植体，可先用用加有洗涤剂剂的水清洗10-15分分钟，再用流流水冲洗干净净。2、表面灭菌菌（1）操作人人员穿戴灭菌菌过的工作服服、口罩。进进入接种室前前双手用洗涤涤剂清洗干净净，操作前再再用70%酒酒精或消毒剂剂擦洗双手。。（2）操作期期间双手和台台面常用70%酒精或消消毒剂擦拭。。超净工作台台使用前必须须用紫外灯照照射杀菌，然然后开启风机机。（3）接种用用工具（解剖剖刀、剪刀、、镊子）可放放入70-75%酒精中中，使用时需需火焰灼烧灭灭菌，冷却后后使用。（4）外植体体放入超净工工作台内，置置70-75%酒精中5-60秒秒，0.1氯氯化汞6-10分钟，或或10%的漂漂白粉上清液液中10-15分钟，然然后用无菌水水冲洗3-5次。灭菌时时需进行搅动动。表面灭菌剂种种类较多，可可选取1-2种使用。常用灭菌剂使使用浓度及效效果比较表灭菌剂使使用浓度度持续续时间去除的难易效效果次氯酸钙9-10％5-30分钟易很很好次氯酸钠2％5-30分钟易易很很好氯化汞0.1-1％5-10分钟较较难最最好抗菌素4-50mg／L30-60分钟中中较较好酒精70-75%0.2-2分分钟易易好好过氧化氢10-12%5-15分钟最最易易好好三、外植体的的接种—无菌菌接种外植体的接种种是把经过表表面灭菌后的的植物材料切切碎或分离出出器官、组织织、细胞、转转放到无菌培培养基上的全全部操作过程程。整个过程程均需无菌操操作。（1）借助接接种用工具将将材料切割分分离。（2）将培养养基放入超净净工作台内，，火焰灼烧培培养基瓶口，，然后打开培培养瓶口，置置培养瓶为斜斜角，避免灰灰尘落入平中中。（3）迅速将将切割分离下下的所需组织织、细胞、器器官，放入培培养基上，及及时盖上瓶盖盖。（4）工具用用后应及时灭灭菌，避免交交叉污染。（5）工作人人员操作时禁禁止不必要的的谈话。第四节外外植体的培养养接种只是完成成了离体培养养的第一步，，植物离体培培养和栽培植植物一样，生生长过程中也也受到各种环环境因素的影影响。培养条条件是离体培培养能否成功功的关键。在在培养基条件件适宜的基础础上，影响试试管苗生长的的主要因素有有光照、温度度、湿度、氧氧气。一、外植体的的培养条件1、光照光照对植物生生长发育有重重要作用，是是离体培养中中非常重要的的环境因素。。光照强度、、光质以及光光照时间，对对细胞的增殖殖、器官的分分化都有很大大影响。除特特殊要求外，，一般都采用用日光灯作光光源，光照强强度1000-5000Lx，根据不同植物物或器官需要要，可以每天天连续光照12-16小小时，也可每每天光照16小时，8小小时黑暗。2、温度离体培培养中中对温温度的的控制制比光光照更更为重重要，，大所所数植植物最最适温温度在在23-32℃℃之间间。培培养室室温度度是25±±2℃℃。低低于15℃℃时，，培养养的组组织生生长停停顿，，高于于35℃对对生长长也不不利。。因此此，培培养室室应安安装空空调机机或其其他的的控温温设备备。3、湿湿度培养瓶瓶内相相对湿湿度通通常是是100%，而而环境境中的的相对对湿度度会直直接影影响培培养基基的水水分蒸蒸发。。因此此，培培养过过程中中，培培养室室一般般要求求相对对湿度度保持持在70-80%，，相对对湿度度过低低影响响培养养物生生长和和分化化，应应向室室内喷喷洒水水，以以提高高湿度度；过过高杂杂菌滋滋生，，大量量污染染，应应及时时地通通风除除湿。。4、氧氧气离体培培养的的试管管苗是是需要要氧气气的，，在固固体培培养或或液体体静置置培养养时，，如果果组织织完全全浸入入培养养基中中，与与氧气气隔绝绝，就就会停停止生生长。。因此此，接接种时时要有有部分分组织织合空空气接接触。。振荡荡培养养是解解决通通气的的良好好办法法。固固体培培养中中，如如瓶塞塞不透透气，，培养养物也也不能能生长长，要要选择择通气气性好好的培培养瓶瓶盖，，增加加可利利用的的氧气气，迅迅速除除去释释放出出来的的CO2，有利于于外植植体外外层细细胞开开始分分裂。。二、外外植体体的成成苗途途径外植体体的成成苗途途径有有三种种：（一）外外植体-愈伤组组织-完完整植株株。具体又可可分为三三种：1、愈伤伤组织-同时长长芽和根根-植株株。2、愈伤伤组织-茎-根根-植株株。3、愈伤伤组织-根-芽芽-植株株。（二）外外植体-胚状体体-植株株。可从从以下几几种培养养物中产产生：1、器官官上发生生。2、愈伤伤组织上上发生。。3、游离离单细胞胞发生。。4、小孢孢子发生生。诱导胚状状体比诱诱导芽数数量多、、速度快快、结构构完整。。（三）外外植体-直接形形成根与与芽-植植株。如如茎尖培培养三、培养养中常见见问题（一）污染的原因及及其预防防措施1、污染原原因污染是指指在组织织培养过过程中培培养基和和培养材材料滋生生杂菌，，导致培培养失败败的现象象。病原菌：：细菌及及真菌两两大类。。⑴细菌污污染特点点-菌斑呈黏黏液状，，接种后后1-2天发现。。污染途径径：外外植体体带菌培养基及及器皿灭灭菌不彻彻底操作人员员未遵守守操作规规程⑵真菌污污染的特特点-污染部分分长有不不同颜色色的霉菌菌，接种种后3-10天发现。。污染途径径：周周围环境境不清洁洁超净工作作台过滤滤装置失失效培养瓶的的口径过过大2、污染的的预防措措施⑴防止材材料带菌菌的措施施-茎尖作外外植体时时，进行行预培养养（无糖糖）或暗暗培养。。无糖营营养液或或自来水水使枝条条抽枝，，以新抽抽嫩枝作作外植体体。-晴天取材材，下午午取材，，经日晒晒过可杀杀死部分分细菌或或真菌。。-接种时除除去外部部韧皮组组织，只只接内部部的分生生组织。。（2）外植体体的灭菌菌-多次灭菌菌法，次次氯酸钠钠-无菌水-次氯酸钠钠-多种药液液交替浸浸泡法，，肥皂水水-酒精-次氯酸钠钠-无菌水。。⑶器皿与与金属器器械的灭灭菌玻璃器皿皿可采用用湿热灭灭菌或干干热灭菌菌金属器皿皿一般火火焰灭菌菌，也可可干热灭灭菌⑷布质制制品的灭灭菌湿湿热灭灭菌⑸无菌操操作室的的灭菌2%新捷尔灭灭或70%酒精擦拭拭（喷雾雾），紫紫外灯照照射，定定期甲醛醛和高锰锰酸钾熏熏蒸。⑹严格按照照操作程程序。（二）外外植体的的褐变及其防止止措施。。1、褐变的的原因褐变是指指外植体体在培养养过程中中体内的的多酚氧氧化酶被被激活，，使细胞胞内的酚酚类物质质氧化成成棕褐色色的醌类类物质，，这种致致死的褐褐变物向向外扩散散致使培培养基逐逐渐变成成褐色，，抑制其其它酶的的活性，，影响外外植体的的分化，，最后变变褐死亡亡的现象象。⑴基因型型某某些植物物酚类物物质含量量较多。。⑵外植体体的生理理状态幼幼年年的材料料培养含含醌类物物质较少少。⑶培养基基的成分分-过高的无无机盐浓浓度-生长调节节物质使使用不当当，BA过多-分生能力力强的材材料，氧氧化受抑抑制，褐褐变也被被抑制-培养条件件不适宜宜，温度度过高或或光照过过强，褐褐变加速速。⑷材料转转移时间间时时间过长长引起材材料褐变变。2、褐变的的防止措措施⑴选择适适宜的外外植体及及最佳培培养基。。⑵连续转转移。⑶加抗氧氧化物。。⑷加活性性炭。0.1-0.5%活性炭（三）玻璃化现象及其其预防措措施1、玻璃化化现象及及其产生生原因玻璃化是是在细胞胞生长过过程中的的环境产产生变化化，试管管苗为了了适应变变化了的的环境而而呈玻璃璃状。主主要原因因是：⑴激素浓浓度BA浓度提高高，导致致玻璃化化苗的产产生。⑵琼脂浓浓度琼琼脂浓度度低，玻玻璃化苗苗增加。。⑶温度低低温易易形成玻玻璃化苗苗。⑷光照时时间一一般要求求10-12h，大于15h玻璃苗增增加。⑸通风条条件培培养瓶容容量小，，气体交交换不良良，玻璃璃化苗多多。⑥离子水水平植植物种类类不同，，离子形形态比例例量要求求不同。。2、预防措措施⑴控制无无机营养养成分，，降低氮氮（铵态态氮）和和氯。⑵提高蔗蔗糖和琼琼脂浓度度⑶降低细细胞分裂裂素和赤赤霉素浓浓度，增增加生长长素比例例。⑷增加自自然光照照1000-1800lx，控制光光照时间间8-12h。⑸适温温生长，，热击处处理防止止玻璃化化发生。。⑥使用透透气性好好的封口口膜。⑺培养基基中加入入间苯三三酚、根根皮苷或或多效唑唑、矮壮壮素。第五节试试管管苗的驯驯化移栽栽一、试管管苗的特特点1、试管苗苗的生态态环境组织培养养出来的的苗通称称试管苗苗或组培培苗。试管苗长长期生活活在密闭闭容器中中，形成成其独特特生态系系统，与与外界环环境相比比，有四四大差异异⑴高恒温温试管苗整整个生长长过程中中采用的的是恒温温培养，，温差很很小。并并且温度度一般控控制在25+2℃甚至更高高。外界环境境条件温温度不断断变化，，其调节节由太阳阳辐射决决定，温温差很大大，而且且一般不不会达到到25+2℃。⑵高湿试管瓶内内水分移移动途径径有两条条：试管苗水水分从气气孔蒸腾腾培养基向向外蒸发发，凝结结后又进进入培养养基水分移动动循环造造成瓶内内相对湿湿度接近近100%，远远大大于瓶外外空气湿湿度，故故试管苗苗蒸腾小小。⑶弱光试管瓶内内光照一一般比太太阳光弱弱，幼苗苗生长也也较弱，，不能受受太阳光光直接照照射。⑷无菌试管苗所所在环境境无菌，，与外界界有菌环环境不同同，试管管苗也无无菌，同同时，培培养瓶内内气体环环境较为为特殊，，与外界界环境有有很大差差异。2、试管苗苗特点⑴试管苗苗生长细细弱、茎茎叶表面面角质层层不发达达⑵叶绿体体的光合合作用较较差⑶叶片气气孔数目目少，活活性差⑷根的吸吸收功能能差⑸对逆境境的适应应性和抵抵抗能力力较差二、试管管苗的驯驯化1、驯化的的目的提高试管管苗对外外界环境境条件的的适应性性，提高高光合能能力，使使试管苗苗健壮，，提高试试管苗移移栽成活活率。2、驯化原原则调节温湿湿光和无无菌等环环境要素素，开始始和培养养条件相相似，后后期与预预计栽培培条件相相似。3、驯化方方法将长有完完整试管管苗的培培养瓶由由培养室室转到伴伴遮荫的的自然光光下锻炼炼，并打打开瓶盖盖注入少少量自来来水使幼幼苗逐渐渐降低温温度，转转向有菌菌，一般般进行1-2周。三、试管管苗的移移栽1、常规移移栽法将已诱导导出大量量根的试试管苗，，驯化3-5天，移到到无菌混混合土中中，当长长出2-3片新叶时时，栽到到田间或或盆钵中中。2、直接移移栽法直接将试试管苗移移栽到盆盆钵的方方法。3、嫁接移移栽法用试管苗苗做接穗穗嫁接在在同一植植物的实实生苗上上。嫁接移栽栽优点：：1、移栽成成活率高高。2、适用范范围广，，嫁接移移栽也适适用于弱弱苗或污污染苗。。3、需时间间短，20天成活，，缓苗期期10-15天。4、植株生生长发育育较快。。四、提高高试管苗苗移栽成成活率的的途径1、壮苗移移栽比弱弱苗移栽栽成活率率高2、生长素素（NAA）利于生生根3、低无机机盐浓度度生根效效果好4、活性炭利利于嫩茎生生根5、避免太阳阳直射，温温度25-30℃，湿度在85%以上6、使试管苗苗逐渐从无无菌向有菌菌过渡思考题：1、分别写出出MS、N6、White培养基特点点。2、写出培养养基高压灭灭菌操作程程序。3、简述植物物离体培养养的无菌操操作程序。。4、玻璃化现现象的原因因及其预防防措施。5、试分析外外植体培养养中污染的的防治措施施。6、说明试管管苗驯化原原则、目的的和方法。。7、简述提高高试管苗移移栽成活率率途径。9、静夜四四无邻，，荒居旧旧业贫。。。1月-231月-23Sunday,January1,202310、雨中黄黄叶树，，灯下白白头人。。。14:43:5014:43:5014:431/1/20232:43:50PM11、以我独沈久久，愧君相见见频。。1月-2314:43:5014:43Jan-2301-Jan-2312、故人江海别别，几度隔山山川。。14:43:5014:43:5014:43Sunday,January1,202313、乍见翻翻疑梦，，相悲各各问年。。。1月-231月-2314:43:5014:43:50January1,202314、他乡乡生白白发，，旧国国见青青山。。。01一一月月20232:43:50下下午14:43:501月-2315、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。一月232:43下下午1月-2314:43January1,202316、行动出成成果，工作作出财富。