第四章植物组织培养技术四

第四节植物花药和花粉培养花药培养和花粉培养：

指离体培养花药和花粉，使花粉改变原来的配子体发育途径，转向孢子体体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株从中鉴定出单倍体植株并使之二倍化的细胞工程技术单倍体的应用潜力①克服后代分离，缩短育种年限；

②选择效率高；

③有利于隐性基因控制性状的选择；

④快速获得纯合自交系；

⑤其他：复壮；远缘杂交；进行花粉发育等的理论研究。一、培养材料的选取与制备（一）材料选择（二）预处理（三）外植体制备（一）材料选择基因型：培养材料的基因型是影响花药培养诱导单倍体成功的最重要因素之一。2.花粉发育时期3.生理状态（二）预处理低温处理：将花蕾用湿纱布包裹后再用塑料袋封装，放在冰箱中冷藏高温处理（热激处理）高温和低温交替处理黑暗处理高糖液处理激光照射其他方法（三）外植体制备花药和花粉培养中的表面灭菌通常先用70%－75%乙醇浸润花蕾30s左右，然后在孢和漂白粉溶液(上清液)中浸泡10-20min，或在0.1%氯化汞溶液中处理5-10min，之后用无菌水漂洗3-5次。由于花药和花粉粉培养所取材料是未开放的花蕾，其内部的花和花粉实际上处于无菌状态，表面灭菌在能杀灭花蕾表面微生物的前提下，处理的强度以尽可能轻为好。花蕾经表面灭菌后，需在无菌条件下录取花药，接种在培养基上。花粉培养来说说，需制备花花粉外植体：：①自然释放法法。②研磨过滤收收集法。③机械游离法。。④磁拌法。二、植株再分分化（一）脱分化化培养1.培养方式的选选择2.基本培养基的的选择3.培养温度的选选择4.生长调节物质质的选择5.碳源的选择6.其他添加成分分1.培养方式的选选择（1）固体平板培培养：固体培培养基上进行行培养（2）液体培养：：在液体培养养基表面进行行培养（3）双层培养：：在固体——液体双层培养养基进行培养养（4）分步培养：：花药-花粉分步培养养（5）条件培养：：用预先培养养过花药的液液体条件培养养基再次进行行花药培养（6）看护培养：：（7）微室培养2.基本培养基的的选择（1）常用的培养养基有MS、Nitsch、B5、N6、H、Miller培养基等（2）基本培养基基的影响实质质上是无机盐盐离子浓度、、氮源总浓度度、铵态氮和和硝态氮的浓浓度和比值等等差异造成的的3.培养温度的选选择离体培养的花花药(花粉)在培养初期对对温度比较敏敏感，大多需需要在25〜28°C下培养4.生长调节物质质的选择在花药和花粉粉培养的脱分分化阶段，生生长调节物质质的选择是最最重要的坏节节。花药和花粉培培养的主要内内容是生长调调节物质的筛筛选，包括生生长调节物质质的种类、浓浓度及配比。。生长调节物物质的选择，，主要根据植植物种类和植植株再生方式式来进行。5.碳源的选择碳源的选择包包括碳源浓度度和各类的选选择，以适应应不同植物种种类离体花药药和花粉小孢孢子脱分化过过程中对渗透透和异养能源源物质的要求求。一般来说，单单子叶植物比比双子叶植物物要求更高浓浓度的碳源，，前者一般5%以上，高者可可达到15%，后者一般3%左右。大多数情况下下，采用蔗糖糖作为碳源都都可获得较好好的结果，但但采用其他糖糖作为碳源可可或多或少提提高培养的效效果。6.其他添加成分分（1）活性炭（2）水解酪蛋白白（3）维生素C（4）维生素A（5）聚乙烯吡哆哆酮（6）硝硝酸酸银银（7）三三十十烷烷醇醇（三三））再再分分化化培培养养胚状状体体途途径径（1）直直接接胚胚状状体体发发生生：：从从离离体体培培养养的的花花药药和和花花粉粉直直接接产产生生胚胚状状体体（2）间间接接胚胚状状体体发发生生：：离离体体培培养养的的花花药药和和花花粉粉先先形形成成胚胚性性愈愈伤伤组组织织，，然然后后再再由由胚胚性性愈愈伤伤组组织织分分化化出出胚胚状状体体2.器官官发发生生途途径径1.胚状状体体途途径径（1）通通过过胚胚状状体体途途径径再再生生植植株株的的，，都都是是那那些些很很容容易易做做花花药药(花粉粉)培养养的的基基因因型型或或从从极极佳佳生生理理状状态态的的母母株株上上取取到到的的处处于于最最适适宜宜发发育育时时期期的的花花药药(花粉粉)（2）对对于于直直接接胚胚状状体体途途径径来来说说再再分分化化培培养养一一般般只只是是将将完完成成了了诱诱导导脱脱分分化化的的花花药药和和花花粉粉进进行行转转管管培培养养。。在在少少数数情情况况下下，，转转管管培培养养所所用用的的培培养养基基成成分分和和培培养养方方式式可可以以和和脱脱分分化化培培养养阶阶段段完完全全相相同同，，多多数数情情况况下下，，这这种种转转管管培培养养要要做做有有别别于于脱脱分分化化培培养养阶阶段段的的适适当当调调整整2.器官官发发生生途途径径通过过器器官官发发生生型型途途径径再再生生植植株株的的分分化化培培养养中中.最重重要要的的是是选选择择适适宜宜的的生生长长调调节节物物质质类类、、浓浓度度和和配配比比。。生生长长素素和和细细胞胞分分裂裂素素共共同同作作用用调调控控愈愈伤伤组组织织形形态态发发生生的的模模式式可可以以用用来来指指导导花花药药和和花花粉粉培培养养中中愈愈伤伤组组织织分分化化器器官官的的培培养养。。（四四））炼炼苗苗和和移移栽栽三、、单单倍倍体体植植株株鉴鉴定定和和染染色色体体加加倍倍（一一））花药药和和花花粉粉植植株株的的倍倍性性（二二））花花药药和和花花粉粉植植株株倍倍性性鉴鉴定定（三三））花花药药和和花花粉粉单单倍倍体体植植株株的的染染色色体体加加倍倍（一一））花花药药和和花花粉粉植植株株的的倍倍性性1.由花花药药和和花花粉粉培培养养获获得得的的植植株株，，倍倍性性多多样样。。2.花药药植植株株倍倍性性混混杂杂的的原原因因：：①体体细细胞胞组组织织的的干干扰扰。。②生生殖殖细细胞胞的的自自发发加加倍倍（二二））花花药药和和花花粉粉植植株株倍倍性性鉴鉴定定形态态鉴鉴定定（1）一一般般情情况况下下，，单单倍倍体体植植株株的的形形态态为为植植株株瘦瘦弱弱、、叶叶片片窄窄小小、、花花小小柱柱头头长长，，而而多多倍倍体体植植物物的的形形态态为为植植株株健健壮壮、、叶叶片片宽宽大大、、花花大大柱柱头头短短（2）显显微微镜镜下下观观察察叶叶片片气气孔孔保保卫卫细细胞胞的的长长度度，，是是近近年年来来采采用用较较多多的的细细胞胞倍倍性性鉴鉴定定法法。。一一般般情情况况下下，，倍倍性性越越高高气气孔孔越越大大，，单单位位面面积积气气孔孔数数目目越越小小。。2.结实实性性鉴鉴定定单倍倍体体植植株株、、三三部部体体植植株株和和非非整整体体植植株株虽虽然然都都能能开开花花但但不不结结实实；；二二倍倍体体植植株株则则开开花花结结实实都都正正常常；；四四倍倍体体植植株株虽虽能能开开花花和和结结实实，，结结实实性性不不良良，，但但经经过过长长期期选选择择淘淘汰汰，，其其结结实实性性可可能能提提高高。。3.染色体数目目鉴定采用涂片法法(或压片法)和去壁低渗渗法，通过过检查根尖尖或茎尖染染色体数目目，排除嵌嵌合体的干干扰，可同同时对根尖尖以外的细细胞，如嫩嫩叶细胞、、花粉母细细胞等的染染色体进行行观察。4.遗传标记鉴鉴定（1）生化标记记鉴定：以基因表达达产物蛋白白质为主的的一类标记记系统，常常用的是同同工酶标记记。（2）分子标记记鉴定：标记检测的的是植物基基因组DNA水平的差异异5.流式细胞仪仪鉴定法（三）花药药和花粉单单倍体植株株的染色体体加倍1.在常规条件件下处理用0.02%〜0.4%秋水仙素处处理花药和和花粉单倍倍体植株2.在组织培养养条件下处处理用秋水仙素素加倍也可可在组织培培养条件下下进行。常常用的方法法有两种：：一是在培培养基中加加入秋水仙仙素进行培培养；二是是在培养过过程中单独独用秋水仙仙素溶液浸浸泡培养材材料，然后后置于不含含秋水仙素素的培养基基中培养。。第五节植植物胚胎培培养（一）胚胎胎培养的概概念1.胚胎培养：：指使胚或具具胚器官（（如子房、、胚珠等））在离体无无菌条件下下发育成幼幼苗的技术术。广义的胚胎胎培养还包包括胚乳培培养和试管管受精等技技术。一、植物胚胚胎培养的的概念和应应用（二）植物物胚胎培养养分类胚培养：指在无菌条条件下将胚胚从胚珠或或种子中分分离出来，，置于培养养基上进行行培养的技技术。一般分为幼幼胚培养和和成熟胚培培养。幼胚培养则指胚龄处处于早期原原胚、球形形期胚、心心形期胚、、鱼雷期胚胚的培养。。成熟胚培养养一般指子叶叶期至发育育成熟胚的的培养，其其培养较易易成功。幼胚：原原胚－球球形胚－心心型胚－鱼鱼雷胚－子子叶胚球形胚前期期心型胚前期期鱼雷胚球形胚2.胚乳培养胚乳培养指指对处于细细胞期的胚胚乳组织进进行离体培培养的方法法。3.胚珠培养胚珠培养是是指未受精精或受精后后的胚珠离离体培养。。4.子房培养子房培养是是指授粉和和未授粉的的子房培养养5试管受精试管受精指指在无菌离离体条件下下培养离体体的未受精精子房或胚胚珠和花粉粉，使花粉粉萌发产生生的花粉管管进入胚珠珠从而完成成受精过程程。(二)植物胚胎培培养的应用用克服远缘杂杂交的不育育性，获得得稀有杂种种植物打破种子休休眠，提早早结实，缩缩短育种年年限使生活力低低下或无生生活力的种种子萌发使柑橘类植植物合子胚胚正常发育育测定种子活活力获三倍体或或单倍体植植株快速繁殖特特殊植物用于理论研研究二、植物胚胚培养（一）胚培培养的方法法是将受精后成熟（未成熟）种子或果实，用70%酒精表面消毒几秒钟，再用0.1%升汞溶液或饱和漂白粉溶液消毒10min，无菌水反复冲洗。1.成熟胚培养养一般指子叶叶期至发育育成熟胚的的培养，其其培养较易易成功。2.幼胚培养则指胚龄处处于早期原原胚、球形形期胚、心心形期胚、、鱼雷期胚胚的培养。。（二）离体体胚形态发发生及影响响因素离体胚形态态发生（1）正常胚胎胎发育：成熟胚在适适宜的培养养条件下，，维持胚的的生长进行行正常的胚胚胎发育过过程，直至至形成再生生植株。（2）胚性发育育：幼胚生长增增大至正常常胚大小甚甚至超过正正常胚，但但不能萌发发成幼苗。。可通过提提高培养基基渗透压进进行调整，，也可以用用生长素或或天然营养养物调节使使胚正常生生长。（3）早熟萌发发：幼胚在培养养中越过正正常胚发育育阶段，在在未达到生生理和形态态成熟时迅迅速萌发长长成幼苗，，这一现象象称为早熟熟萌发。这这样产生的的苗往往畸畸形、细弱弱、难易成成活。因此此，幼胚培培养应防止止早熟萌发发。（4）产生愈伤伤组织在幼胚培养养中常常能能在追加生生长调节剂剂时诱发愈愈伤组织产产生，进而而分化形成成胚状体或或不定芽。。2.离体胚培养养影响因素素（1）培养基常用的培养养基种类包包括：成熟熟胚培养-Tukey、Randilph和Cox、White、MS、B5（1968）；未成熟熟幼胚培养养-Rijven、Rappaport、Rangaswamy、Norstog、Nitsh、B5、MS不同发育时时期的胚要要求蔗糖浓浓度不同，，通常胚龄龄越小要求求蔗糖浓度度越高培养基pH对幼胚生长长也十分重重要。一般般pH范围在（2）附加物氨基酸类。。无论是单一一的还是复复合的氨基基酸都能刺刺激胚的生生长。·维生素类。。各种维生素素一直被用用于胚培养养中，对初初期幼胚一一般是必须须的。天然提取物物。CM、各种胚乳乳汁、酵母母提取物，，麦芽提取取物等天然然营养被广广泛使用生长调节剂剂。不同植物的的胚培养对对生长调节节剂的需求求很不一致致。情况比比较复杂。。（3）环境条件件弱光和黑暗暗更适宜幼幼胚培养，，因为胚在在胚珠内发发发育时不不见光的，，但是到萌萌发时器需需要光。光光有利于胚胚芽生长，，黑暗有利利于胚根生生长，因此此，以光暗暗交替培养养更佳。（4）培养材料料材料基因型型不同，胚胚培养的难难易程度也也不同。发发育阶段以以越幼嫩的的胚越难以以培养。（5）胚乳的看护护培养培养极早期期的胚困难难较大，胚胚乳看护培培养在一定定程度上有有助于早期期培养的成成活与发育育。三、植物胚胚乳培养（一）胚乳乳培养方法法和培养后后代特征1.胚乳培养方方法（1）外植体取取材：取待胚乳细细胞的种子子（或果实实）表面灭灭菌后，无无菌条件下下剥离胚乳乳组织接种种。植物材料胚胚乳发育类类型及发育育时期直接接影响外植植体取材时时期以及胚胚乳细胞产产生愈伤组组织频率。。（2）培养基的的选择①基本培养养基。诱导愈伤组组织常用基基本培养基基是MS、LS、White，其中MS使用频率最最高。适当当添加生长长调节剂。。②有机添加加物。各种植物胚胚乳组织的的培养对培培养条件要要求类似。。胚乳培养时时，培养基基配合使用用生长素，，细胞分裂裂素和天然然营养物（（即有机氮氮源），效效果显著。。③“胚因子子”。胚在胚乳培培养中的作作用问题早早期研究认认为胚是必必须的。④pH。2.培养后代特特征成熟和未成成熟胚乳培培养可诱导导产生愈伤伤组织或直直接进行器器官分化。。只有能分分化的胚乳乳愈伤组织织才能产生生器官分化化。长期培养的的胚乳愈伤伤组织，细细胞染色体体数目常发发生变化，，如多倍化化、非整倍倍体等。胚胚乳组织培培养再生植植株。不一一定保持原原来倍性。。（二）胚乳乳培养器官官发生1.胚乳培养器器官发生途途径胚乳培养中中，仅仅少少数寄生和和半寄生植植物可以从从胚乳直接接分化出器器官，大多多数植物都都不行，都都需要先形形成愈伤组组织，再进进行分化。。2.胚乳培养器器官发生影影响因素欲使胚乳组组织培养分分化茎芽，，必须使用用一种外源源细胞分裂裂素，其中中2ip具有极其显显著促进胚胚乳组织分分化茎芽的的效果，激激动素的使使用效果也也十分明显显。四、植物胚胚珠和子房房培养植物胚珠和和子房培养养指已经授授粉和未授授粉胚珠和和子房的离离体培养。。（一）胚珠珠培养培养方法：：从花蕾中取取出子房，，表面消毒毒后在无菌菌条件下剥剥取胚直接接中培养。。培养基常常用Nitsh、Ms、N6、B5等，添加IAA、IBA、2,4-D等激素和YE、CM、CH等营养物质质及糖和维维生素。离体胚珠培培养成功的的关键（1）材料基因因型（2）发育时期期（3）胎座组织织。（4）附加成分分（二）子房房培养1.培养方法：：受精后子房房仍需要进进行表面消消毒接种。。而未受精精子房可将将花被表面面消毒后，，在无菌条条件下直接接剥取子房房接种。子子房培养对对培养基要要求不严格格，如MS、White、Nitsch等均可。需需要添加适适量有机成成分和激素素2.影响培养成成功的因素素（1）材料选择择（2）花被组织织（3）生长物质质（4）未授粉子子房在固体体培养基上上的培养方方式以子房房直插比子子房平方效效果更好。。第六节植物物离体授粉受受精一、植物离体体授粉的概念念和意义（一）离体授授粉（离体受受精）：离体授粉指在在无菌条件下下培养未受精精子房或胚珠珠和花粉，使使花粉萌发进进入胚珠，完完成受精过程程。因全过程从花花粉萌发到精精卵细胞融合合形成种子，，直至种子萌萌发产生幼苗苗均在试管内内完成，故称称为离体受精。（二）离体授授粉（离体受受精）意义：：二、植物离体体授粉方法（一）收集花花粉：开花前数天（（因不同植物物而异）套袋袋，开花前一一天或当天取取花蕾或花药药，表面消毒毒后，无菌条条件下离体收收集花粉。（二）剥取子子房或胚珠：：做母本的花蕾蕾在开花前数数天去雄并套套袋，开花前前一天取花蕾蕾在实验室进进行常规表面面消毒之后，，在无菌条件件下剥取胚珠珠（带胎座或或否）或子房房培养。（三）离体受受精方法1.子房试管授粉粉（1）直接引入法法。无菌条件下用用锋利刀片将将子房壁或子子房顶端切开开一个小口，，把花粉悬浮浮液直接滴入入切口后进行行培养。（2）注射法。用无菌注射器器吸取花粉悬悬浮液，从子子房基部或上上端切口注入入子房，基部部切口可用凡凡士林封口，，然后接种于于培养基上。。2.胚珠试管授粉粉：胚珠剥离后可可从胎座上切切下单个胚珠珠授粉，也可可将带着完整整胎座或部分分胎座的胚珠珠接种并撒播播花粉。（1）哺育法。将胚珠表面先先蘸满有助于于花粉萌发的的培养基，然然后撒上花粉粉后培养。（2）接近法。将花粉预先撒撒于培养基上上培养使之萌萌发或不萌发发，然后接种种胚珠（甚至至子房）培养养三、影响离体体受精的因素素（一）胚珠（（子房）的成成活率及育龄龄胚珠（子房））离体成活率率的关键是培培养基成分的的筛选；有的植物开花花时适于受精精，有的植物物开花前适于于受精（二）母体组组织的影响柱头的影响；；胎座的影影响（三）花粉萌萌发和花粉管管生长关键的因素仍仍然是培养基基。往往适宜宜胚珠离体培培养的培养基基不利于花粉粉萌发和花粉粉管伸长。后后者需要添加加钙、硼离子子。本章作业一、名词解释释植物细胞全能能性：外植体：脱分化：愈伤组织：继代培养：再分化：胚状体（体细细胞胚）：植物组织和器器官培养：植物离体无性性繁殖。不定芽型器官官发生：器官型器官发发生:器官发生型器器官发生。胚状体发生型型器官发生原球茎型器官官发生脱毒苗指示植物：花药培养和花花粉培养：胚胎培养：胚培养：胚乳培养子房培养:成熟胚培养:幼胚培养:正常胚胎发育育:胚性发育：早熟萌发胚乳看护培养养:“胚因子”:离体授粉（离离体受精）：：污染:褐变:玻璃化:二问答题1.生长素、细胞胞分裂素和赤赤霉素的应用用及相互作用用？2.离体条件外植植体的分化过过程？3.植物离体无性性繁殖中器官官发生方式4.茎尖分生组织织带毒低的主主要原因5.单倍体培育的的意义6.单倍体的鉴定定方法7.植物胚胎培养养的意义8.离体胚形态发发生的方式有有哪些？9.胚乳、胚珠和和子房培养的的意义8.什么是“胚因因子”“花被被因子”？9.什么是离体授授粉？（离体体受精）10.离体授粉的意意义？11.植物离体授粉粉方法12.污染的原因及及预防措施？？13.褐变的原因及及预防措施？？9、静静夜夜四四无无邻邻，，荒荒居居旧旧业业贫贫。。。。1月月-231月月-23Sunday,January1,202310、雨中中黄叶叶树，，灯下下白头头人。。。13:14:5313:14:5313:141/1/20231:14:53PM11、以我独沈久久，愧君相见见频。。1月-2313:14:5313:14Jan-2301-Jan-2312、故人人江海海别，，几度度隔山山川。。。13:14:5313:14:5313:14Sunday,January1,202313、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。1月-231月-2313:14:5413:14:54January1,202314、他乡生生白发，，旧国见见青山。。。01一一月20231:14:54下午午13:14:541月-2315、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。一月231:14下下午1月-2313:14January1,202316、行动出成果果，工作出财财富。。2023/1/113:14:5413:14:5401January202317、做前，能能够环视四四周；做时时，你只能能或者最好好沿着以脚脚为起点的的射线向前前。。1:14:54下下午1:14下下午13:14:541月-239、没有有失败败，只只有暂暂时停停止成成功！！。1月-231月-23Sunday,January1,202310、很多事事情努力力了未必必有结果果，但是是不努力力却什么么改变也也没有。。。13:14:5413:14:5413:141/1/20231:14:54PM11、成功就是日日复一日那一一点点小小努努力的积累。。。1月-2313:14:5413:14Jan-2301-Jan-2312、世间成事事，不求其其绝对圆满满，留一份份不足，可可得无限完完美。。13:14:5413:14:5413:14Sunday,January1,202313、不知香积积寺，数里里入云峰。。。1月-231月-2313:14:541