第二章-基因工程的酶学基础

第二章基因工程的酶学基础Enzymes一、限制性核酸内切酶第一节限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。

（Restrictionendonuclease）2.性质内切酶主要来源于原核生物即在核酸分子链的内部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保护作用3.功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1.来源由寄主控制的限制和修饰现象---20世纪60年代，Linn和Arber发现(B)(K)大肠杆菌B大肠杆菌K114×10—

410—4E.O.P成斑率efficiencyofplating外源DNA自身DNA核酸限制性核酸内切酶的发现：切酶。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。限制—修饰的酶学系统(B)(B)酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰基因组DNA不被切割Ⅰ型限制性内切酶目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型Ⅱ型限制性内切酶

Ⅲ型限制性内切酶IV型限制性内切酶限制性核酸内切酶的类型及其主要特性

特性1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中

I型双功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点5‘端至少1000bp不是（随机）无用

II型限制酶和修饰酶分开单一成分

Mg2+位于识别位点上是非常有用

III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3‘端24-26bp处是用处不大1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：三、限制性内切酶的命名用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示2.

如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如HindⅡ：d菌株

EcoRI：抗药性R质粒

3.如果一种特殊殊的菌株内有有几种不同的的限制与修复复系统，用罗罗马字母表示示该菌株中发发现某种酶的的先后次序。如HindⅡ：d菌株中发现的的第二个酶4.所有的限制酶酶，除以上名名称外还要冠冠以系统名称。限制性内切切酶的系统命命名为R，甲基化酶为为M。如R.HindⅢ表示限制性内内切酶M.HindⅢ表示相应的甲甲基化酶实际应用中，，R常被省略。首先由和在1970年从流感嗜血血菌中分离出出来。（1）识别位点序序列未甲基化修饰饰的双链DNA上的特殊靶序序列（多数是是呈典型的旋旋转对称型的的回文结构））4-6bp。与DNA的来源无关，，即没有种的特特异性。四.Ⅱ类类限制性内内切酶的基基本特性分离的第一一个酶是HindⅡ稀有切割限限制酶（rarecutter）可以识别6个以上的核核苷酸序列列的少数的的限制内切切酶。如NotI（GCGGCCGC）某些限制性性内切酶的的识别序列列中，某一一个或两个个碱基并非非严格专一一。如HindⅡ可识别4种核苷酸序序列：Y:C或TR:A或GGTYRAC-3’5’-EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

产生平齐末端（2）切割位点切开双链DNA，形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：识别位点处处含有几个核核苷酸单链的末端。分两种类型型：GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’[1]粘性末端（stickyends，cohensiveends）ⅰ）5’端凸出（如如EcoRI切点）CTGCAGGACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAGGACGTCⅱ）3’端凸出（（如PstI切点）i）不同的DNA双链：只要粘性性末端碱碱基互补补就可以以连接。。这比连接接两个平平齐末端端容易得得多。[2]粘性末端端的意义义①连接便利利ii）同一个DNA分子内连连接：通过两个个相同的的粘性末末端可以以连接成成环形分子子。[3]平齐末端端（bluntend）在识别序序列的对称轴上上同时切割割5’-GATATC-3’3’--5’CTATAG如EcoRV不同来源源的酶，，识别相同同的序列列，切割方式式相同或或不同。。识别位点点和切点点完全相相同如HindⅢ和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’[5]同裂酶（（Isoschizomer)①完全同裂裂酶：XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别位点点相同，，但切点点不同。。如XmaI和SmaI。②不完全同同裂酶：：识别的序序列不同同，但能能切出相同同的粘性性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤呤；Y代表嘧啶啶。[6]同尾酶(Isocaudamers）限制性内内切酶的的识别和和酶切活活性一般般在一定定的温度、离离子强度度、pH等条件下下才表现现最佳切切割能力力和位点点的专一一性。如果改变变反应条条件就会会影响酶酶的专一性和和切割效效率，称为星星号（*）活性性。所以一般般使用专专一的反反应缓冲冲液。影响限制制酶的酶酶活性的的因素星号（*）活性性EcoRI和BamHI等都有*活性。。在低盐、、高pH（>8）时可识识别和切切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的时候要要特别注意！！7诱发星号（*）活性的原原因ⅰ）高甘油含量量ⅱ）内切酶用量量过大ⅲ）低离子强度度ⅳ）高pHⅴ）含有机溶剂剂，如乙醇ⅵ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二价阳离子子的存在酶量不宜过多多，尽量遵循循生产商推荐荐的反应条件件从细菌DNA环化现象推测测，必定存在在一种能把两两条DNA双链连接到一一起的酶。第二节DNA连接接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制一定有断断口DNA连接酶:一种能够催化化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶1967年，世界上数数个实验室几几乎同时发现现了一种能够够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶。（1）大肠杆菌连连接酶1.两种共价连接接DNA限制片段的DNA连接酶连接粘性末端，准确性高,NAD+齐平末端，效效率低二、DNAligase的特点（2）T4噬菌体的连接接酶不但能连接粘粘性末端；还还能连接齐平平末端DNA-DNARNA-RNADNA-RNAATP（1）必须是双链DNA（2）DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸酸基团（P）（3）需要能量ATP或NAD+2.DNA连接酶催化的的连接反应特特点（4）只能连接缺缺口（nick），不能连接裂口口（gap）。是两条链－因此不能将两两条单链连接接起来或使单单链环化起来来。OHP××××是相邻的－因此只能封闭闭nick.不能封闭gapgapNONickOK三、DNA连接酶酶的反应条件件Tris-HCl50-100mM，pH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃，4-16hr1.反应温度理论37℃黏性末端：12～16℃平头末端：10～20℃2.ATP浓度一般，ATP最适的终浓度度为0.5mmol/L.ATP浓度高至5mmol/L，影响平头末末端的连接ATP浓度高至7.5mmol/L，抑制粘性末末端及平头末末端的连接。。四、影响连接接反应的因素素3连接酶的浓度度：平末端DNA分子的连接反反应中，最适适1～2个单位。粘性末端DNA片段之间的连连接，0.1个单位。时间：16℃4小时4℃过夜增加插入片段段与载体的接接触机会，减减少同一个分分子末端自我我连接的现象象。4.DNA末端的浓度3:1插入片段与载载体的浓度比比例两种构型：线线状分子和环环状分子与DNA浓度及DNA分子长度相关注意事项：10xLigationBuffer含有ATP，使用前应在在室温放置至至融化或用手掌温度辅助融化，然然后置于冰上上。不要加热热融化以免ATP降解。T4DNALigase对热敏感，容容易失活。使使用时请放置冰上，用后立即置置冰箱中冷冻保存。。第三节DNA聚合酶酶和反转录酶酶DNA聚合酶（DNApolymerase)能在引物和模板的存在下，把把脱氧核糖多多核苷酸连续续地加到双链DNA分子引物链的3’－OH末端，催化核核苷酸的聚合合作用.一、基因工程程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修饰过的T7DNA聚合酶6.逆转录酶7.TaqDNA聚合酶1.共同特点把dNTPs连续地加到引引物的3’－OH端2.主要要区区别别T7DNA聚合合酶酶可以以连连续续添添加加数数千千个个dNTPs而不不从从模模板板上上掉掉下下来来。。有的的DNA聚合合酶酶只只能能连连续续添添加加10多个个dNTPs就会会从从模模板板上上解解离离下下来来。。二、、常常用用的的DNA聚聚合合酶酶的的特特点点持续续合合成成能能力力和和外外切切酶酶活活性性不不同同。。DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高3.常常用用DNA聚聚合合酶酶的的特特性性比比较较三、、DNA聚聚合合酶酶在在基基因因工工程程中中的的用用途途1.大肠肠杆杆菌菌DNA聚合合酶酶Ⅰ主要要用用来来制制备备带带放放射射性性标标记记的的DNA探针针（（32P标记记））。。（1）大大肠肠杆杆菌菌DNA聚合合酶酶Ⅰ的性性质质①一一条条单链链多多肽肽②5’’3’’外切切酶酶活活性性位位于于N端③用用枯草草杆杆菌菌蛋蛋白白酶酶处理理可可以以切切掉掉N端的的5’’3’’外切切酶酶活活性性部分分,就成成为为Klenowfragment。2.Klenowfragment具有有5’’3’’聚合合酶酶活活性性和和3’’5’’外切切酶酶活活性性。。（（失去去了了5’’3’’外切切酶酶活活性性）。。（1）Klenowfragment的性性质质DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草草杆杆菌菌蛋蛋白白酶酶①3’’端补补平平5’’5’’klenow②DNA3’’末末端端标标记记补平平限限制制性性内内切切酶酶切切后后形形成成的的3’’隐蔽蔽端端。在3’’隐蔽蔽端端加上上放放射射性性标标记记的的dNTP。klenow（2））主主要要用用途途3’’隐蔽蔽末末端端的的DNA片断断Klenowfragment补平平根据据末末端端的的顺顺序序选选择择一一种种-32P-dNTPs末端端标标记记的的DNA限制制性性内内切切酶酶切切5’’----G3’’3’’----CTTAA5’’5’’----GAA3’’3’’----CTTAA5’’5’’----GAATT3’’3’’----CTTAA5’’5’’----G3’’3’’----CCTAG5’’5’’----GG3’’3’’----CCTAG5’’5’----GGATC3’’3’----CCTAG5’’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h③cDNA第第二链链的合合成mRNA逆转录录cDNA第二链链klenow5’3’3’5’5’3’引物（1）T4DNA聚合酶酶的性性质3.T4DNA聚合合酶从T4噬菌体体感染染后的的大肠肠杆菌菌培养养物中中分离离纯化化，由由噬菌体体基因因43编码。。有5’3’聚合酶酶活性性和3’5’外切酶酶活性性（降降解单单链更更快））。①来来源②酶酶活性性③特特点A当没有有dNTP时，T4DNA聚合酶酶行使使3’5’外切酶酶功能能，制制造出出3’隐蔽端端。B如果只只有一一种dNTP，则降降解到到该dNTP的位置置。C在四种种dNTP均存在在时，，聚合合活性性占主主导地地位。。5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶酶无dNTPsT4DNA聚合酶酶有dNTPs5’5’（2））T4DNA聚聚合酶酶的用用途标记末末端（（取代代合成成法或或置换换合成成法））用3’5’’外切酶酶活性性作用用于所有末末端形形式的的3’端（平端端、3’隐蔽端端、5’隐蔽端端）制制造出出3’隐蔽端端。再利用用它的的5’3’’聚合酶酶活性性补平平，并并加入入放射射性标标记的的dNTP。①补补平隐隐蔽末末端②DNA3’末端标标记4.T7DNA聚合合酶（1）来源源从T7噬菌体体感染染大肠肠杆菌菌细胞胞中纯纯化出出来的的，由由两个个亚基基组成成：①T7噬菌体体基因因5编码的的大亚亚基：：T7噬菌体体5蛋白有5’3’聚合酶酶和3’5’外切酶酶活性性。②大大肠杆杆菌编编码的的小亚亚基：：硫氧还还蛋白白增加大大亚基基对模板的的亲和和性。（2））T7DNA聚合合酶的的特点点①持持续合合成能能力强强一旦与与模板板结合合就会会不间间断地地合成成互补补链。。②3’5’外切酶酶活性性高单链和和双