通过单克隆抗体技术识别肉的种类以及加热肉品终点温度的确认

通过单克隆抗体技术处理加热过的肌肉蛋白质来识别肉的种类以及加热肉品终点温度的确定

Y-H.P.Hsieh,F.C.Chen,和N.djurdjevic

Auburn大学食品科学和营养系

AuburnAlabana36849

肉制品的质量和安全已引起消费者以及管理机构的广泛关注。在生肉制品质量控制，加强食物安全和分类管理方面酶连免疫吸附技术(ELISA)被认为是一种十分有效和适合的检测分析方法，为了定量的确定加热产品中搀杂肉的全部种类,在ELAISA技术中,许多单抗体已经被逐渐探索应用。在作用于加热处理过的肌肉蛋白质的过程中，单抗体技术已经得到发展.随着加热终点温度的增ELISA反应的程度也随之增加，可以用MABS(单克隆抗体技术)来检测肉品中特定的肉种类。因此,MABS可以用作决定预煮肉品的最大内部加热温度，以此来确保产品的安全性.在本节中主要介绍了现行的技术和实验操作过程,特点以及MABS的应用。1．

介绍

因为经济的损失，食物过敏及宗教信仰方面的因素，肉品中搀杂不明肉类在很大程度上欺骗了消费者。联邦法律要求肉制品必须贴上标签以证明包含肉的种类。在许多国家已报道了肉类替代现象，例如在英国马肉被用作牛肉羊肉。马肉和袋鼠肉在加拿大发现被用作出口的牛肉。猪肉被用作牛肉和羊肉出口到中东地区。随着食品企业中机械去骨肉使用量的增加，最近,人们已越发的关注多种加工过程和预煮肉类以及分割肉产品。美国农业部食品安全和检测服务局（USDFA-FSIS）的管理条例中对使用机械分割肉做了如下的规定：只要求使用一类肉的肉制品中不要包含任何别的种类的机械分割肉。然而，由于不正当的交易和全国性经济欺骗现象的存在，国内零售市场中在鱼及陆生动物肉类产品中混入不知名的杂肉已成为一种普遍现象。研究表明煮制品比原料制品存在更高的搀杂现象，在一种产品中加入多种不知名的肉类也是一个十分普遍的现象。肉类应被煮制足够的时间，有利于人类的消化吸收，也可以确保消灭其中的病原微生物。在食用鲜肉和禽类制品时不正当的烹调被认为是引起传染疾病的一个主要因素。USDA-FSIS已特别规定肉制品加热过程的指导方针,对于每种肉应有多种预煮制品。例如，未干制的禽类制品中心温度必须加热到71.1℃，而干制的禽类制品也必须加热到68.3℃来杀死沙门氏菌.为了确保消除大肠杆菌O157，烤牛肉的PH值.应控制在7左右加热温度68.3℃。别的制品PH值为7，加热温度为71.7℃。鲜猪肉加热时内部温度应达到76.7℃，而且杀死旋毛虫温度应至少比此温度再高17℃。然而，一旦肉品中搀杂了别的不知名肉类，由于不知名肉类的存在对于特定种类的最低内部加热温度也就失效了。为了阻止肉类的搀杂和减少由于不足够加热过程引起的食物传染疾病的危害，对于管理监督部门来讲,采用可靠分析方法来执行肉类管理程序是十分必要的。最理想的方法具有特定，反应灵敏，快速，经济性，高检测率的特点，并且能够提供量性的结果。尽管在每一种条件下单一的方法并不一定能够满足所有的要求，但选择ELISA用于肉类的检测可以满足最多的要求。多克隆抗（PABS）和单克隆抗体（MABS）技术都已用在ELISA中，MABS比PABS有更多的优点：连续使用，稳定的特性和免疫试剂相近性。在免疫分析中使用MABS可以提供独一无二的试剂，并且可以减少分析的费用，MABS已被用在原料肉种类的鉴定。因为作用于正常状态下蛋白质的抗体在大多情况下不能识别加热处理后肉中的蛋白质，实验室中使用MABS来检测加热肉品中搀杂的肉的种类。在全部加热处理过的肉品混合物中MABS可以对目标品种的含量就行定量检测，而且可以决定预煮肉的最大中心加热温度。我们主要讨论MABS的实验操作过程特性和它的应用.在本章中也对这两种领域内的现行方法进行了大概的评价2搀杂肉品种类的确认\

2.1非免疫学方法

在过去的二十年中，许多用于确认肉品种类的非免疫方法例如电泳和色谱层析已经有了很大的发展。对于蛋白质的分离电泳技术是十分有效的，不同的肌肉蛋白质的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）经常产生相同的蛋白类型，所以在肉种类确认方面它的可信度十分的小。等吸附技术基于蛋白质不同的等电点可以把蛋白质依据不同种类而分开，这种技术被广泛用于确认鱼肉的的种类类，也也可以以用于于区分分不同同种类类的原原料肉肉。但但是，，当混混合肉肉中存存在多多种肉肉或蛋蛋白添添加剂剂时,很难难解释释其检检测结结果。。色谱谱法如如气相相色谱谱,液液体色色谱和和高精精度色色谱已已经被被广泛泛用于于肉种种类的的确认认，这这种方方法是是基于于对肉肉样中中脂肪肪酸成成分，，组氨氨基酸酸或蛋蛋白质质形状状的检检验来来实现现的。。这些些方法法可以以区分分不同同个体体肉的的种类类，但但是由由于色色谱类类型复复杂度度的增增加，，这些些方法法在检检测复复合肉肉品中中掺杂杂肉的的种类类时会会失效。。随着分分子生生物学学技术术的高高速发发展，，包括括DNA杂交交技术术，聚聚合酶酶链反反应应和碎碎片分分析技技术已已对法法医学学产生生了革革命命性的的变革革，对对于食食品科科学也也是如如此。。DNA杂杂交技技术已已被用用于多多中肉肉类品品种的的确确认,下一一步准准备也也进行行基因因组DNA或克克隆隆DNA同同目标标DNA的的杂交交，同同时用用颜色色或自自行x射线线照相相技术术进行行检测测工作作。这这些方方法在在用于于煮制制肉类类品种种确确认方方面面是独独特的的并且且十分分有用用,但但是是在确确认联联系密密切肉肉类时时效效果不不好下下一步步准备备显示示牛，，绵绵羊，，山羊羊基因组组DNA水水平上上的的相互互交叉叉反应应。通通过混混合未未标记记DNA修修饰DNA杂杂交可可以减减少交交叉反反应，，从从而而可以以从交交叉杂杂交种种类中中区分分绵羊羊和山山羊，，大约约有10﹪的的区别别限限度。。绵羊羊和山山羊肉肉类类的区区分是是使用用直接接连续续技术术来对对比核核苷苷酸的的次序序而实实现的的，同同时时也分分析了了限制制核苷苷酸内内切酶酶聚合合酶链链反应应的产产物，，由由于费费用高高和操操作的的复杂杂性，，这些些基于于DNA水水平平的技技术未未被常常规分分析方方法所所采纳纳。2.2免免疫学方法法免疫学方法法是基于特特定抗体－－抗原反应应，它适用用于分析复复杂混合物物中的成分分，同时此此成分有最最低的检测测量。从本本世纪开始始，免疫技技术已被用用于动物肉肉类品种的的确认。免免疫技术的的先进之处处在于它可可以在很大大程度是提提高检测的的敏感性和和结果的准准确性。沉沉淀环实验验是免疫分分析方法的的一个简单单形式，它它的原理是是在实验管管中抗血清清和肉的抗抗原相汇处处可产生可可见的环。血血凝抑制实实验是基于于阻止抗原原血清清和它它的同类抗抗原之间积积极的反应应，而此同同种类抗原原被同种外外来羊的红红血细胞所所包裹。琼琼脂胶体免免疫扩散，，双层免疫疫扩散技术术起源于Ouchyeriony(1948)的描述述，同时也也涉及抗血血清和抗原原在半固体体琼脂胶体中的扩扩散。经过过隔夜培养养后在抗体体和它对应应的抗原相相汇处形成成一个可见见的不透光光的带。USDA-FSIS肉类检查查员对这种种技术做了了一定的修修缮，使用用标定的试试剂纸片和和提前准备备的琼脂平平板使此种种技术在检测测原料肉的的种类时更更加便利.由于琼脂脂凝胶免疫疫扩散实验验灵敏性易易变化，培培养的时间间长，并且且非肉的成成分干扰大大，所以限限制了它在在完整鲜肉肉分析中的的应用。免免疫分析经经常用在临临床处置中中，但是一一项研究指指出,用I标记免免疫试剂检检测出牛牛肉中存在在5﹪的其其他成分分。由于于放射免免疫分析技技术要用有有害的放射射材料，并并且要用闪闪烁计数器器，所以限限制了它在在日常检验和检测测肉种类中中的应用。。ELISA由于下面面的优点而而在肉种类类的确认中得得到了十分分广泛的应应用：不用用太贵的科科学仪器，，易于操作作，免疫试试剂用量小小，可应用用于大数量量，宽领域域的检测。。经常应用用的有三种种类型:间间接ELISA竞争争，ELISA,夹夹心ELISA。间间接ELISA,先把抗原原吸入一个个微量平板板上，之后后相反动物物的抗体与与抗原结合合吸附在固固体层上，，通过二者者与随后加加入的反免免疫球蛋白白的结合，，通过外来来添加酶而而形成的颜颜色.它可可以检测到到抗原与抗抗体的结合合物。竞竞争ELISA技技术是基基于提取样样品中有限限的抗体，而自由由抗原和与与固体相结结合的抗抗原与抗体体竞争相结结合。固体体相抗原原结合的特特定种类抗抗原的限制制数同液体体相中的的抗原数成成正比。夹夹心ELISA使使用固固体相上的的抗体作作为结合抗抗体。另一一种抗体体用作检测测抗体。所所以，这便便形成了了一个夹心心，抗原位位于中间，，抗体在抗抗原分子子的两侧。。在表1中中对不同类类型ELISA用各各种肉的的抗原对原原料肉的确确认进行了了总结。最最近，单抗抗体技术也也应用在ELISA中来对原原料肉进行行确认，ELISA也用于煮煮制肉品种种类的确认认中。2.3抗抗体的来来源在使用酶免免疫测定来来确认肉的的种类成功功的发展的的过程中，，最重要的的是特定种种类的抗体体，不同种种动物需要要不同的免免疫试剂。。传统的来来讲，在ELISA中应用的的单抗体体来自免疫疫动物的血血清。多克克隆抗体技技术在自然然界中是外外源的，亚亚群和特定定种类抗原原或相反种种类抗原相相结合。因因此可以十十分容易的的观测到血血清和相关关种类抗原原的交叉反反应。在检检测程度标标准化的发发展过程中中，一组抗抗体亲和力力和结合特性的变化化也引起了了人们的关关注。同多多克隆抗体体技术相反反，单克隆隆抗体技术术的来源－－单细胞链链在自然界界中是是同源的。。它们来自自融化得抗抗体分泌物物Blymphocytes,而这种种分泌物又又来自患有有骨髓瘤的的免疫老鼠鼠。融化的的产物叫杂杂交细胞，，可以在培培养基中生生长，并且且可以继续续的分泌抗抗体。经过过仔细的镜镜检和亚克克隆后，可可以挑选出出稳定的杂杂交细胞链链，它可以以分泌出针针对某一特特定抗原的的抗体，而而且产生抗抗体十分频频繁。采用用单抗体的的方法来对对肉的种类进进行免疫分分析时，应应保证连续续供应统一一的免疫试试剂，也应应减少标准准分析程序序。2.4抗抗原的选择择大多数对于于原料肉种种类的免疫疫检测方法法都采用多多克隆方法法来处理整整个血清清或血清清蛋白。因因为血清蛋蛋白的存在在可能是必必须的，肌肌肉组织中中残余的血血浆成分会会发生变化化，那么便便意味着肌肌肉组织的的存在，进进而可以得得出结论：：用这些多多克隆技术术来定量的的估计搀杂杂物的量是是不可靠的的。肌肉蛋蛋白质的存存在是显著著的,预示示了鸡肉组织存在的的可能性比比血清蛋白白存在的可可能性要大大。对于肉肉种类的多多克隆技术术已用于可可溶性粗蛋蛋白的分析析中或净化化肌肉成成分，例如如肌钙蛋白白和肌红蛋蛋白。这些些检测方方法的优点点在于容易易获得提取取样品，更更重要的一一点在于对对传统检测测方法的改改进与发展展。不溶性性肌肉蛋白白如连接蛋蛋白也可可以用于单单抗体的分分析方法中中，来确认认原料禽肉肉的种类。。然而不溶溶性蛋白的的提取需需要特殊的的步骤。这这些方法毫毫无疑问问的可以应应用于法律律事件的检检测中，但但不适用于常常规检验分分析或产地地检验。因为通过加加热处理后后，大多的的蛋白质变变性并且成成为不可溶溶的，所所以使用抗抗体来处置置本源蛋白白质的方法法不可以以用于加热热处理过的的肉类。对对于加热热的肉类的的确认也应应用热稳定定蛋白。在在解决特特定种类热热稳定性组组成方面已已做了十十分大的努努力。用IEF方法法，Jones和和Mortiner(1985)说明明了来自自肾上腺和和肌肉组织织的BE抗抗原蛋白具具有热稳定定性。但但是不同类类型BE抗抗原的特性性是显著不不同的，Sherikar使使用SDS-聚丙稀酰胺凝凝胶电泳的的方法检测测了不同同种类的BE抗原，，并且得出出结论在BE蛋白中中肌钙蛋白白T属属于特定定种类蛋白白部分。没没有经经过加加热处理的的从肌肌肉组织织中分离的的具有抗热热性的糖糖蛋白白应用于多多克隆抗体体技术中。。这些抗体体已应用于于夹心ELISA中中用于鉴别别加热和罐罐装肉类食食物中。。这些方法法在商业检检测中是十十分有效的的，并并且也应用用于USDA对加热热肉品种类类确认的调调查中。大大多对于加加热肉品种种类的确确认中大大都使用多多克隆抗体体技术方法法.最近在在我们实验验室中对单单克隆抗体体技术确认认加热肉种种类的研究究中也取得得了一定定的进进展。用用于加热处处理肉类蛋蛋白鉴别的的单克隆抗抗体技术也也可用于原原料肉的鉴鉴别中中，因为在在准备检测测样品时这这些原料肉肉可以十分分容易的被被加热处理理。3单克隆隆抗体技术术用于加热热处理肌肉肉蛋白的确确认

3.1单克克隆抗体介介绍用于热稳定定性或抗热热性蛋白的的不同抗原原已经用于于发展抗体体技术来确确认加热肉肉品的种类类。热稳定定性这一个个词在字典典中被十分分清晰的定定义，大多多情况下，，它指经过过加热处理理的肉类浸浸提物中保保持可溶性性和抗抗原性的完完整蛋白或或蛋白碎片片。如果果一种特定定分析蛋白白已知应用用于一种特特定的种类类确认,那那么在免疫疫分析技术术中使用提纯蛋蛋白可以增增加对于特特定种类抗抗原决定基基的免疫反反应机会。。然而对于于杂交瘤的的分泌物并并不一定完完全需要提提纯蛋白作作为抗原，，由于在挑挑选适宜特特定种类蛋蛋白主要方方面缺少足足够多的知知识技术，，所以在单克克隆抗体技技术中我们们使用加热热处理过的的可溶性粗粗肌肉蛋白白作为免疫疫源。在加加热之后，，纯的肉类类蛋白质显显著减少，，这样在提提取物中只只有热稳定定性或热抗抗性的部分分蛋白质仍仍保持可溶溶性。对期期望的特性性应用MABS（（单克隆抗抗体技术））检测时应选择杂杂交克隆分分泌物，而而且必须要要经过仔细细的镜检和和亚克隆。。对于准备备抗原有两两种方法:1)用蒸蒸馏水或盐盐水对粗瘦瘦肉进行搅搅拌，过滤滤物可以作作为免疫原原。2）瘦肉混混于0.15MNACL中，，沸水加热热并且离心心.上层液液121℃℃30分钟钟高温灭菌菌过滤，用用90﹪乙乙醇进行萃萃取，沉淀淀，干燥物物溶于盐溶溶液中备用用。来自免免疫老鼠的的脾细胞与与骨髓瘤细细胞融合后后可作为杂杂交产物。。在我们的的实验室中中，遵守守由Kohler和和Milstern描述的一一般程序，，那便是在在随后的步骤中中要进行行必要的的修饰。。ELISA镜镜检是用用于经过过选择实实验的与与抗原原对应应的克隆隆体，同同时用异异种的浸浸提物和和别的的食物蛋蛋白通过过交叉反反应来稳稳定杂交交物。。杂交产产物具有有我们所所期望的的特性，，之之后通过过限定性性稀释程程序对之之克隆至至少两两次以获获得稳定定的单克克隆细胞胞链。SDS和免免疫点点技术用用于确认认每每种单克克隆隆肉类浸浸提物种种抗原的的成分。。3.2单单克隆隆抗体的的特点目前为止止，五种种免疫球球蛋白单单克隆抗抗体技术术在实验验中已用用于掺杂杂肉种类类的检检测。单单克隆抗抗体2F8同五五种经过过加热的的哺乳动动物肉发发生十十分强烈烈的反应应，但但不同任任何加热热的禽肉肉发生反反应。3E12同禽肉肉反应应，5D2主要要用于鸡鸡和火鸡鸡的鉴别别中。9C6只只特定于于鸡，5H9只只用于猪猪肉。第第一组组四四种单克克隆抗体体技术用用于经水水或盐水水浸提提过的经经过加热热处理的的肌肉蛋蛋白，它它们同同特别的加加热肉提提取物发发生了强强烈的反反应，但但不同原原料肉和和加热处处理后的的肉相作作用。免免疫印迹迹结果表表明所有有的单克克隆抗体体同加热热处理肉肉提取物物中两条条或更多多条蛋白白带发生生反应，，除了5H9以以外，但但它可检检测猪猪肉浸提提物中中单一带带。5H9也同同原料猪猪肉浸提提物的三三个蛋白白带发生生反应，，带有24KD的蛋白白质可以以被确认认为猪猪肉特特定定的热稳稳定肌肉肉蛋白。。所有的单单克隆抗抗体也发发展成对对骨骼肌肌具有特特定的反反应。表表3说明明了5H9对于于不同猪猪肉组织织和食物物蛋白的的免疫反反应，也也同时说明明了5D2的特特性反应应.这些些单克隆隆抗体对对于特定定骨骼肌肌而具有有的特点点不同于于别的已已报道的的结果，，别的报报道讲已已观察到这些些抗体对对器官，，心肌，，或平滑滑肌的交叉反反应。基基于特定定肌肉的的单克隆隆抗体分分析可以以对样品品中瘦肉肉进行定定量分析析检测。对对于定量量分析来来讲抗原原均匀的的分布在在不同动动物的半半天肌肉肉组织中中是十分分重要的，，所以抗抗原的量量决定于于同样品品中一定定目标肌肌肉组织织的分析析反应，，而不用用考虑肌肌肉切面面的位置置。单克克隆抗体体5H9用于于定量检检测牛肉肉制品中中不同切切面的猪猪肉含量量。无论论是使用用间接非非竞争还还是竞争争性ELISA技术，，都表示示在肉不不同的切切面整整个浸提提物蛋白白浓度和和猪肌肉肉组织得得测定数数量水平平没有不不同。这这些结果果暗示，，由单克克隆抗体体5H9所检测测得抗原原组成对对于制制造商十十分的适适用，它它可用于于定量检检测肉样样中猪瘦瘦肉。表4确确认加加热肉种种类时作作用于加加热处理理蛋白质质的单克克隆抗体体的鉴别别特性单克隆抗体类型亚型鉴别种类抗原蛋白质分子重量（kD)2F8IgG2b牛肉，猪肉，羊肉，马肉，鹿肉

18.5－26.53E12IgG1鸡肉，火鸡肉，鸭肉

22－345D2IgG1鸡肉，火鸡肉

22－359C6IgG1鸡肉

120，33.55H9IgG1猪肉

243.3掺掺杂肉类类的检测测如表5所所示，间间接ELISA反应的的吸光度度或者竞竞争性ELISA反应应所表达达的抑制制百分率率和牛肉肉中猪肉肉的百分分量对数数之间存存在线形形关系。。表6所所展示的的是使用用间接和和竞争ELISA应用用单克隆隆抗体5D2来来定量检检测猪肉肉中鸡肉肉含量的的药剂反反应水平平曲线,应用间间接和竞竞争性ELISA系统统来检测测我们的的单克隆隆抗体可可以得到到一致的的结果，，说明这这些单克克隆抗体体在肉制制品的快快速检测测或者掺掺杂肉种种类的确确认方面面是十分分有效的的。检样掺杂违规规程度的判断断受限于分析析方法所能达达到的最低检检测水平，应应用传统的琼琼脂胶体检测测方法，它的的最低检测量量通常在5－－10﹪。ELISA的的应用已经提提高了检测能能力，但不能能检测肉样中中含量十分低低的掺杂肉类类。采用了了我们的分析析程序，这些些分析方法对对于掺杂种种类含量的检检测能力在0.5－1﹪﹪之间,可可以同大多的的已报道的用用于肉种类类确认的ELISA方法法相比。对于于实际应用来来讲，掺杂杂肉1﹪的检检测能力力对于官官方的常规分分析检测已足足够。现在确认肉种种类的商业ELISA方方法一次只能能对单一的种种类进行定量量检测。如果果把之应用到到管理当中，，使用这些ELISA方方法来检测测大量样品中中复杂的肉种种类是十分费费时的而且花花费十分大，，如果用单一一检测方法来来区分不同肉肉的种类会更更昂贵更费力。例例如应用单克克隆抗体2F8来检测加加热家禽肉制制品中普通的的哺乳动物肉肉的种类，应用用单克隆抗体体3E12对对加热的牛肉肉或猪肉中的的禽肉进行单单一检测，为为了进一步的确确认，从最初初的检测中得得到的明确的样品品，接下来可可以用单种类类的分析方法法进行来确认认存在的特定定种类。3.4未来来的发展单种类的单克克隆抗体技术术的发展比多多种类的发展展更难，主要要因为对于特特定种类抗原原确认所检测测的天然蛋白白抗原比动物物学相关种类类的检测蛋白白抗原更更稀少。对对于包括特定定种类抗体的的肌肉蛋白的的确认可以为为单种类单克克隆抗体的有有效产物提供供有价值的信信息。猪类中中24kd热热稳定肌肉蛋蛋白的发现可可以促进单一一体的应用，，来确认特特定种类肌肌肉蛋白同同别的种类相相似或一致。对于于恢复多种类类的抗原有很很多影响因素素，例如PH值，盐含量量，加热方法法，而且为了了获得准确的的定量结果也也应对基质进进行仔细的研研究。与此同同时也应大力力推进基于单单一体的传感感和别的免疫疫测定方法和和发展，例如如用一步分析析可以用于确确认搀杂的水水平。4加热终点温温度的确认4.1非非免疫方法美国农业部使使用基于减少少蛋白溶解性性或是酶活性性的各种方法法来验证肉制制品是否加热热到所需的最最低终点温度度。依据产物物的类型和所所需的终点加加热温度来选选择使用的方方法。现行的的方法包括凝凝结实验，作作用于加热温温度低于65℃的牛肉和和猪肉产品，，酸性磷酸盐盐反应方法作作用于灌装汉汉堡，后蝤肉肉和午餐肉.牛过氧化氢氢酶实验作用用于数量十分分少的烘烤和和加热牛肉，但这些方法法自身由于其其经验主义和和主观主义而而受到批评。。在提高现有有方法方面已已做了十分多多的尝试而且且已形成了新新的方法可以以更准确的确确定加热终点点温度。许多多技术，例如如电泳法，色色谱法，微分分扫描测热计计以及近红外外线光谱法也也在尝试着应应用在加热终终点温度确定定过程中。大大部分这些方方法主要的影影响因素是解解释实验结果果的困难性,加热终点点温度相对精确确的估计，并且需要高高尖的设备，，操作人员要要进行培训。。Callins等认为为乳酸脱氢酶酶在猪肉和和牛肉加热终终点温度确定定中可作为分分析检测指标标，因为酶的的活性同加热热中终点温度度和搀杂肉的的加热终点温温度呈反比例例的关系。另另外，许多方方法对内源酶酶的剩余放射射性进行检测测，如磷酸激激酶，丙酮酸酸激酶，转氨氨酶，氨基葡葡糖酶和磷酸酸丙糖异构酶酶，同时这些些检测方法也也被推荐用于于准确的控制制肉制品的加加热过程。4.2免疫疫方法

4.2.1乳乳酸脱氢酶的的抗体禽类制品所需需的加热终点点温度.火鸡鸡胸脯肉足足够加热过程程的指标建议议是乳酸替代代了检测酶活活性ELISA应用单单克隆和多克克隆抗体检测测本源乳酸脱脱氢酶的方法法已运用到定定量测定减少少酶的浓度，，进而可以确确定火鸡和牛牛肉制品的终终点加热温度度，这个方法法可以区分1℃以下和71.1℃以以上加工的火火鸡胸脯肉的的乳酸脱氢酶酶的浓度，这这正是非干制制脱氢酶，它它最合理的浓度为0.3㎎/kg肉.其结结果不受盐含含量，产品包包装尺寸，，烟熏时间表表或是加热过过程之前肉肉经过冷冻贮贮藏的影响。。然而，这种种方法在区分分加热68.9℃和和71.1℃火鸡大腿腿肉时效果果不好。因因为在鸡胸脯脯和大腿肉中中存在的酶有有不同的热稳稳定性。因为为肌肉类型和和贮存条件会会影响个体酶酶的数量和稳稳定性，所以以大多方法会会在使用时遇遇到困难，这这些方法基于于特殊酶的浓浓度或活性性来实现的的，而分布布在肌肉组组织中个体体酶时变化化的。4.2肌肌肉蛋白质质的单克隆隆抗体基于监控平平均分布的的肌肉蛋白白质反应的的方法，可可以更好的的确定加热热终点温度度。同加热热肉品反应应的单克隆隆抗体指示示在不同温温度下同加加热肉肉品产生的的不同反应应，这一观观察结果暗暗示了使用用单克隆抗抗体来检测测肌肉蛋白白质热变性性而作为肉肉制品足够够加热过程程的指示指指标的潜在在性，因为为在此方法法中使用的的MABS便是为了了应用于加加热处理的的肌肉蛋白白质。我我们应用ELISA技术分别别使用单克克隆抗体2f8和单单克隆抗体体5d2来来研究不同同内部加热热温度的牛牛肉和鸡肉肉。如如表7所示示，当样品品加热到60℃或更更低时和可可溶牛肉蛋蛋白质浸提提物相结合合的单克隆隆抗体2f8是十分分少的。当当加加热温度从从60℃升升到66℃℃时ELISA反应应只有轻微的增增强。在表表7a可以以看到牛肉肉加热在60－66℃和80℃之间时时免疫方法法显著的增增加。在60－66℃范围内内ELISA反应和和加热样品品温度是线线形关系，从而而这种方法法可以预测测加热牛肉肉的加热终终点温度并并且在样样品中有有95﹪的的可信度，，误差为±±1℃。在在加热鸡胸胸脯肉中也也观测到了了单克隆抗抗体5D2的相同对对应温度但但同之呈线线性系的温温度范围为为60－74℃.同一定定酶或蛋白白质可溶性性减少或活活性削减典典型测定相相比这种方方法有更好好的应用性性，因为它它可以通过过