印迹杂交技术

第八章印迹杂交技术1第一节核酸分子杂交的基本原理基本概念:核酸分子杂交:

将一种核酸单链标记成为探针．再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源双链核酸分子的过程。杂交体:杂交形成异源双链核酸分子2退火核酸分子杂交不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一些局部碱基互补片段在复性时形成杂化双链，此过程称分子杂交。加热3核酸分子杂交技术:

单链的核酸分子在合适的温度和离子强度下，通过碱基互补形成双链杂交体的一类技术。4核酸杂交技术：

分子探针:带有某种标记物的分子

如核苷酸链片段

退火加热5核酸分子杂交的基本原理

DNA变性:

融解温度(Tm值):50％DNA变性的温度

DNA复性:

核酸杂交：6DNA加热50%DNA发生变性此时的温度——融解温度

（Tm）7DNA的变性与复性8退火核酸分子杂交不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一些局部碱基互补片段在复性时形成杂化双链，此过程称分子杂交。加热9第二节探针与标记一、探针的基本条件①带有标记物，便于分析杂交体②为单链核酸，双链核酸探针使用前需变性解链③具有高度特异性，只与待测核酸杂交④探针序列通常是基因编码序列，因为非编码序列特异性低⑤探针标记灵敏度高而稳定，标记方法简便而安全10

二、探针的种类

1.基因组DNA探针

2.RNA探针

3.cDNA探针

4.寡核苷酸探针11⒈基因组DNA探针基因组DNA探针多为某一基因的全部或部分序列，是最常用的DNA探针。注意:由于真核生物基因组中存在高度重复序列，制备基因组DNA探针应当尽可能选用编码序列，避免选用非编码序列，因为非编码序列特异性低，会得到假阳性的结果122.RNA探针RNA探针是单链探针，和单链DNA探针相比，RNA探针具有成本低和易纯化等优点133.cDNA探针cDNA探针不含内含子等非特异性序列，故特异性高，是一种较为理想的核酸探针；但cDNA不易制备，因而应用受到限制144.寡核苷酸探针寡核苷酸探针是人工合成的DNA探针，其优点是可以根据需要随心所欲地合成，避免选用非特异性序列。大多数寡核苷酸探针长度只有15～30nt，只要其中有一个碱基不配对就会影响杂交，因而特别适合于分析点突变。另外，寡核苷酸探针的复杂性较低，因而杂交所需时间较短15三、探针标记物：㈠放射性同位素标记物用于标记的有32P、3H和35S等

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优越性：①灵敏度极高②不影响各种酶促反应，也不影响碱基配对的特异性和稳定性③具有很高的特异性，假阳性的结果比较少

局限性：①必须随用随标记；②污染环境，同时容易对操作者产生一定程度的伤害17㈡非放射性标记物地高辛标记18

生物素-11-dUTP19荧光素异硫氰酸荧光素罗丹明20四、探针标记的方法

1.切口平移标记法

2.随机引物标记法

3.PCR标记法

4.末端标记法21（一）缺口平移标记法22（二）随机引物标记法23（三）PCR标记法以四种dNTP（其中一种为标记dNTP）为底物，扩增产物即为标记DNA，可作探针使用，其灵敏度和特异性很高。PCR标记法特别适合于合成短序列探针24（四）末端标记法5′末端标记法3′末端标记法25五、探针纯化1.乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，而dNTP等小分子物质则留在上清液中。沉淀2～3次即可将探针片段与杂质分离，达到纯化探针的目的262.凝胶过滤法利用凝胶的分子筛特性，将大分子与小分子有效分离。27第三节核酸分子杂交的基本过程⒈样品制备→⒉电泳分离→⒊印迹→⒋预杂交→⒌杂交→⒍洗膜→⒎分析28⒈样品制备

印迹杂交的前提是获得具有一定纯度和完整性的核酸

29⒉电泳分离

通过琼脂糖凝胶电泳将待测核酸片段按大小分离，然后进行杂交。30⒊印迹(转膜)

将凝胶中的核酸片段转移到固相膜上，转移后各待测核酸片段在固相膜上的相对位置和在凝胶中的相对位置一样。此过程最重要的是要保持核酸片段的相对位置不变。31固相膜：硝酸纤维素膜、尼龙膜活化滤纸

印迹方法毛细管虹吸转移法（毛细转移）真空转移法电转移法（电泳转移）32（1）

毛细管虹吸转移法33（2）真空转移法34（3）电转移法35核酸的固定烘烤：80℃2小时紫外线固定：几分钟碱固定：使用碱溶液转印DNA或RNA过程中，DNA或RNA可以自动地共价地结合到带正电荷或不带电荷的尼龙膜上。36⒋预杂交

将固相膜上能够结合核酸的位点全部封闭

能够结合核酸片段的固相膜同样能够结合探针，为了减少非特异性杂交，消除本底，必须将固相膜上能够结合核酸的位点全部封闭。这样在接下来的操作中，探针将只能与待测核酸杂交。37⒌杂交

用探针与固相膜上结合的核酸进行杂交38⒍洗膜

杂交完毕需要洗膜，即除去固相膜上未杂交的游离探针和形成非特异性杂交体的探针。其中，非特异性杂交体稳定性差，解链温度低，可以在低于解链温度5～12℃的条件下解链，从而洗掉探针，而特异性杂交体则保持与膜结合。39⒎分析

通过放射自显影或化学显色等方法分析杂交体的位置和含量，从而分析待测核酸片段的大小和含量4041第四节核酸分子杂交的分类根据杂交核酸分子的种类：

DNA与DNA杂交

DNA与RNA杂交

RNA与RNA杂交

42根据杂交探针标记的不同：同位素杂交非同位素杂交43根据杂交介质的不同：液相杂交固相杂交原位杂交

点杂交/狭缝杂交菌落杂交Northern杂交Southern杂交44（一）液相杂交：45（二）固相杂交：是把欲检测的核酸样品先结合到某种固相支持物上，再与溶解于溶液中的杂交探针进行反应，杂交结果直接进行放射自显影，然后根据自显影图谱分析杂交结果。461.Southern印迹杂交（DNAblotting）组织或细胞基因组DNA限制酶消化琼脂糖凝胶电泳分离转膜预杂交杂交洗膜放射自显影／化学显色加入探针47482.Northern印迹杂交（RNAblotting）与DNAblotting基本相同

RNA

491975年，SouthernSouthernblotting

（DNA印迹法），用于分析DNA。1977年，Alwine

Northernblotting

（RNA印迹法），用于分析RNA。1979年，Towbin

Westernblotting

（蛋白质印迹法），用于分析蛋白质。1982年，Reinher

Easternblotting

将印迹技术和双向电泳结合分析蛋白质。50DNA样品点到滤膜上1变性2中和3固定DNA4与标记探针杂交5洗脱与显影探针DNA探针标记

变性将探针加到固定的DNA上3.斑点杂交和狭缝杂交514.菌落杂交和噬菌斑杂交

用于重组细菌克隆筛选的固相杂交。5253545.等位基因特异性寡核苷酸杂交法基因突变位点周围的碱基序列是已知的合成15～20nt的两种探针:

正常探针:与正常基因序列互补

突变探针:与突变基因序列互补两者区别是与突变位点对应的碱基不同，称为等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针。55用ASO探针分别与待测DNA进行杂交只与正常探针杂交-正常纯合子

结果与正常及突变探针均杂交-杂合子

只与突变探针杂交-突变纯合子把这种检测基因突变的方法，称为等位基因特异性寡核苷酸杂交法(ASOH)。

56例如:用ASOH技术诊断苯丙酮酸尿症

正常探针：TCCATTAACAGTAAGAATTT突变探针：TCCATTAACAATAAGAATTT5758（三）组织原位杂交：是应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术。59（四）DNA芯片技术60四、基因芯片技术在医学中的应用DNA芯片61例如：表达谱芯片的检测结果，一般可获得3种阳性杂交点图像：

62①Cy5标记的对照DNA与芯片探针形成的杂交点，

为红色，说明对照DNA中存在探针基因高表达②Cy3标记的待测DNA与芯片探针形成的杂交点，

为绿色，说明待测DNA中存在探针基因高表达③由上述两种标记DNA与芯片探针形成的杂交点，

为黄色，说明两种DNA中都存在探针基因高表达63第六节蛋白质印迹法

蛋白质印迹法（Western印迹技术、免疫印迹技术）

原理：将经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离

后的蛋白质转移到特定的固相支持

物上，用第一抗体特异与他的抗原

决定簇结合，结合后的抗体与带有

某种标记的第二抗体结合而被检测.64

操作步骤：

1.蛋白质样品的制备

2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.蛋白质的电转移

4.靶蛋白的免疫学检测

封闭

靶蛋白与第一抗体反应

与第二抗体反应

显色6