市场营销第七节抗体分子的改造和基因工程

第七节抗体分子的改造和基因工程自1975年Catton和Milstein等研究制造出单克隆抗体（MAb）技术以来，获得了迅速的发展和极为广泛的应用。但也确实存在不少难以克服的问题，如绝大多数的Mab是鼠源性的，对人有较强的免疫原性。如果用于人的治疗，不出2周就会产生人对鼠血清的免疫应答，患者体内存在的人抗鼠抗体（humananti-mouseantibody,HAMA），不仅降低了疗效，严重的可引起患者出现血清病。随着分子遗传学、生物化学、特别是分子生物学的发展，人们开始着手利用DNA分子重组技术，改造和生产所需要的特异性单链抗体、免疫粘连素、超变区多肽，直到用丝状噬菌体表面呈现技术构建和筛选抗体基因文库。一、双特异性抗体免疫球蛋白分子具有重链、轻链组成的4条肽链结构，它们共同组成2个抗原结合点。由于2个结合点的抗原特异性相同，故表现为单一特异性。双特异性抗体是将2个结合点表现为不同的特异性，抗体的一个结合点的特异性表现为靶细胞（如肿瘤细胞）结合，另一结合点可与药物（如蓖麻毒素、抗癌药物、细胞毒性细胞）结合。这种双特异性的结合，可使作用物直接地、高密度地作用于靶细胞，提高了疗效，从而可相对地减少对患者的副作用。制备双特异性抗体的方法主要有3种方法：

（1）杂化杂交瘤技术：将具有某种特异性（如抗瘤细胞）的Mab细胞株与具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾细胞进行融合，即产生出杂化杂交瘤细胞株的二价瘤体。它们分泌的是重链、轻链被杂化的抗体分子，有10种形式：重链、轻链都无改变，保持原特异性的配对抗体分子：LH-HL，KG-GK重链特异性相同的配对抗体分子：LH-HK，KH-HKKG-GL，LG-GL重链、轻链特异性不同的配对抗体分子：LH-GK，LH-GLKH-GL，KH-GK在这些杂化抗体分子中，只有LH-GK配对的才是所需的双功能抗体分子。（2）化学交联法：Nisonoff和Rivers最早从事这方面的研究。化学交联的方法无需经过细胞融合，所以比较简便易行。通常利用重链与轻链这间的二硫链经还原和再氧化，将两种不同特异性抗体的半分子结合在一起。或用双功能交联剂，如邻苯酸酯等，把两个抗体半分子交联在一起。

用于制备双双功能抗体体的Mab可以是完完整分子，，也可是经经胃酶水解解获得F（（abˊ））2片段。。后者在减减少鼠源免免疫原性方方面，效果果较好。（3）利用用基因工程程技术将两两套重轻链链基因导入入骨髓瘤细细胞或传染染瘤细胞中中。这种方法制制备的双功功能抗体可可选择合适适的稳定区区和合适的的类及亚类类，而得到到较好的产产量较高的的双功能抗抗体。由于于只有较少少的嵌合导导入并整合合到宿主基基因组，故故传染瘤细细胞更为稳稳定，染色色体不易丢丢失二、嵌合抗抗体在肿瘤治疗疗中，带有有抗瘤药物物或同位素素等的抗体体具有导向向作用，从从而可定位位诊断或定定向杀伤肿肿瘤细胞。。为解决鼠源源免疫Mab免疫原原性这一难难题，人们们又设计了了小鼠-人人工嵌合抗抗体（chimerieantibody））的新型抗抗体。其原理是取取某一Mab基因的的V区，与与人Ig基基因的C区区连接，然然后插入到到表达质粒粒中，传染染骨髓瘤细细胞即产生生出鼠-人人嵌合抗体体。由于Ig的的C区是人人源的，这这种抗体对对人的免疫疫性就大为为降低，采采用不亚类类的人C区区基因，便便可改变抗抗体的效应应功能，以以获抗肿瘤瘤的最佳效效果。鼠-人嵌合合抗体并不不能彻底清清除鼠源免免疫原性，，于是进一一步提出重重构抗体的的设想。即：人化抗抗体三、人化抗抗体抗体的抗原原结合区域域（V）与与空间结构构主要由抗抗体V区中中3个CDRS（互补决决定区）所决定，所所以这一抗抗体的构建建是用原鼠鼠IgV区区中的CDR区插入入到人IgV的框架架区。这样构建成成的重组分分子既保留留了结合抗抗原的功能能，又消除除了鼠源的的免疫原性性。这类人人化抗体（（humanhizedantibodies）也可可称为重构构抗体。为了构建这这类抗体，，首先需要要测出MabV区的的核苷酸序序列，根据据其中的CDRS序列，用全全合成或点点突变的方方法将人Ig重构成成MabV区的CDRS序列列，然后将将这种重构构的V区基基因与人IgC区基基因连接，，构成完整整的人Ig基因，再再于骨髓瘤瘤细胞内表表达。四、单链抗抗体用一编码亲亲水易折叠叠多肽的人人工合成寡寡核苷酸，，将重链V区（3ˊˊ）与轻链链V区（5ˊ）端连连接在一起起（VH-linker-VL）即成成单链抗体体基因，将将此基因克克隆入原核核或真核表表达载体中中，在原核核或真核系系统中表达达出的蛋白白质即为单单链抗体（（singlechainantibodies））。它能自发折折叠成天然然构象，与与抗原的结结合力维持持与原来完完整抗体一一样。五、免疫粘粘连素把细胞受体体或细胞间间粘附分子子（intercellularadhesionmolcule,ICAM）与Ig的Fc段相连，，即为免疫疫粘连素（（immunoadhesin）。Staunton等等制成一种种含有可溶溶性细胞内内粘附分子子-1（1CAM-1）的免免疫粘连素素，它能有有效地和特特异的抑制制被恶性疟疟原虫感染染的红细胞胞对能产生生1CAM-1表面面的粘附。。当被感染染的红细胞胞与上述免免疫粘连素素结合后，，Fc片段段可促使单单核细胞的的吞噬作用用。这种抗体可可用于恶性性疟疾的治治疗。T细胞表面面抗原CD4是爱滋滋病病毒（（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）的受体体，在免疫疫预防和免免疫治疗方方面，免疫疫粘连素可可能会提供供一个新的的途径。将Ig的Fc段与CD4形成成的重组分分子，可以以中和HIV，但只只是简单地地结合会引引起具Fc受体细胞胞的感染，，而在体内内具有Fc受体的细细胞相应是是多的，为为此只有用用定点突变变或其他方方法改变Fc段，使使之不与Fc受体结结合，便可可有效地防防治爱滋病病。六、抗体基基因文库的的构建和基基因表达筛筛选的表面面呈现技术术1985年年Smith将一基基因片段克克隆到载体体噬菌体fd-tet的基因因Ⅲ（g3）上，发发现该基因因所表达的的蛋白与噬噬菌体基因因Ⅲ表达的的蛋白结合合在一起呈呈现到噬菌菌体表面。。这种表达达的融合蛋蛋白仍保留留抗原特异异性和生物物活性，可可通过相应应抗原进行行检测。这样我们不不仅可以利利用噬菌体体来构建基基因文库，，而且可以以获得表达达性的基因因文库，无无疑对高效效率地筛选选和富集目目的基因提提供了极大大的方便。。现在这一技技术已被广广泛地用于于抗体基因因文库，cDNA文文库、随机机多肽基因因文库和突突变基因文文库的构建建和筛选等等诸多方面面。丝状噬菌体体表面呈现现技术以丝丝状噬菌体体为表达载载体，目的的基因插入入到噬菌体体外壳蛋白白基因内，，其天达产产物呈现在在噬菌体表表面。Ff丝状噬噬菌体Ff丝状噬噬菌体呈柔柔性长丝状状，直径约约为6.5nm,野野生型体长长约为900nm。。其基因组组是一单链链环状DNA，全序序列已经测测也，约含含6000多个核苷苷酸，编码码10种蛋蛋白质。其其中有5种种蛋白组成成外壳蛋白白，基因ⅧⅧ（g8））在野生型型噬菌体中中约有2700～3000个个考贝，它它所编码的的gp8蛋蛋白是外壳壳蛋白的主主要成分。。它围绕基基因组DNA以螺旋旋对称的排排列构成圆圆管形的噬噬菌体外壳壳。除gp8外，不不有4种少少量的外壳壳蛋白：gp3、gp6、gp7和gp9，分分别由基因因Ⅲ、Ⅵ、、Ⅶ、Ⅸ编编码，它们们各有5个个拷贝。目的基因表表达的蛋白白如若想在在噬菌体表表面呈现，，就必须插插在这5种种外壳的其其中这一处处。实验表表明，在gp6、gp7、gp9中插插入外源蛋蛋白，都会会影响其构构成外壳蛋蛋白的功能能，而在gp8和gp3的N端插入外外源蛋白后后，形成的的融合蛋白白既可在噬噬菌体表面面呈现，也也不影响噬噬菌体的完完整性和稳稳定性。成熟的gp8含有50个氨基基酸，从构构成外壳的的功能来看看可分为4个部分：：（1）C端端15个氨氨基酸偏碱碱性，与DNA相结结合，构成成外壳的内内壁，在此此处的突变变将影响与与DNA的的相互作用用。（2）25～35位位肽段具有有高度的疏疏水性，借借此特性分分子间相互互聚合，形形成固牢的的外壳。这这段肽链的的改变将会会影响噬菌菌体结构的的稳定性。。（3）从第第6位的脯脯氨酸到C末端是连连续的α螺螺旋结构，，6～24位的螺旋旋肽段外露露，在外壳壳上排列紧紧密，占据据了噬菌体体的大部分分表面。如如有稍大肽肽段插入，，将会影响响外壳的稳稳定性。（4）N端端1～5位位的氨基酸酸序列是丙丙氨酸-谷谷氨酸-甘甘氨酸-门门冬氨酸-门冬氨酸酸（A-E-G-D-D），，它外露于于噬菌体表表面，是外外源肽段插插入的最佳佳位置。利用这一系系统可以构构建表达性性基因文库库，称为噬噬菌体呈现现文库。它它最先被用用于抗体基基因文库的的构建和筛筛选。虽然然利用动物物的免疫可可以获得循循环多克隆隆抗体，用用细胞融合合方法可以以获得单克克隆抗体，，但利用基基因工程的的技术构建建抗体基因因库，再筛筛选所需的的特异性抗抗生，不仅仅摆脱了繁繁重的工作作量，也可可获得大量量的、稳定定的抗体。。而且随着着研究的不不断深入和和发展，抗抗体的多样样性，亲和和力也大有有提高。在构建噬菌菌体呈现抗抗体文库技技术中，主主要有3个个特点：（1）可用用抗原制备备出免疫吸吸附剂，将将文库的噬噬菌体与其其反应，再再经洗涤、、洗脱得以以捕获和纯纯化，将这这种表达所所需的特异异性抗体的的噬菌体感感染大肠杆杆菌而得到到繁殖。如如此经过亲亲和结合→→洗涤→洗洗脱→繁殖殖的富集过过程，称为为“panning”（淘选选），一轮轮paning便可可富集1000倍。。如此简便便、高效率率，是其他他方法比似似的。（2）亲和和力成熟过过程可由体体内转为体体外。如前前所述，抗抗原物质对对动物机体体的再次免免疫，可获获得高亲和和力的抗体体。这种在在体内出现现的亲和力力成熟的现现象，是由由于细胞抗抗体基因在在CDRS区域突变变，再通过过表面呈现现技术加筛筛选，便可可获得亲和和力的特异异抗体（3）这种种方法不仅仅可以获得得单链抗体体，也可制制备出重链链、轻链结结合的抗体体（Fab）片段。。外源基因编编码的肽段段在融合蛋蛋白的N端端，呈现在在噬菌体表表面时，C端锚着在在膜上，N端是游离离的，能够够正确折叠叠，也可以以形成二硫硫链。如果在插入入基因与编编码成熟gp8序列列间放置amber终止码（（TAG）），则TAG就是蛋蛋白质合成成的终止信信号，合成成的多肽以以非融合蛋蛋白的形式式分泌在内内膜与细胞胞壁间的周周质中，进进而还能进进入培养基基中。利用用这些特性性，可将Fc蛋白锚锚着于细胞胞膜上，在在周质中的的分泌的轻轻链分子可可与重链原原位组装。。形成完整整的Fab片段积累累在膜表面面。9、静夜四无无邻，荒居居旧业贫。。。12月-2212月-22Saturday,December31,202210、雨中黄叶叶树，灯下下白头人。。。08:19:3408:19:3408:1912/31/20228:19:34AM11、以以我我独独沈沈久久，，愧愧君君相相见见频频。。。。12月月-2208:19:3408:19Dec-2231-Dec-2212、故人江江海别，，几度隔隔山川。。。08:19:3408:19:3408:19Saturday,December31,202213、乍见翻疑疑梦，相悲悲各问年。。。12月-2212月-2208:19:3408:19:34December31,202214、他乡生生白发，，旧国见见青山。。。31十十二月20228:19:34上午午08:19:3412月-2215、比不了得就就不比，得不不到的就不要要。。。十二月228:19上上午12月-2208:19December31,202216、行动出成果果，工作出财财富。。2022/12/318:19:3408:19:3431December202217、做做前前，，能能够够环环视视四四周周；；做做时时，，你你只只能能或或者者最最好好沿沿着着以以脚脚为为起起点点的的射射线线向向前前。。。。8:19:35上上午午8:19上上午午08:19:3512月月-229、没没有有失失败败，，只只有有暂暂时时停停止止成成功功！！。。12月月-2212月月-22Saturday,December31,202210、很很多多事事情情努努力力了了未未必必有有结结果果，，但但是是不不努努力力却却什什么么改改变变也也没没有有。。。。08:19:3508:19:3508:1912/31/20228:19:35AM11、成功就是是日复一日日那一点点点小小努力力的积累。。。12月-2208:19:3508:19Dec-2231-Dec-2212、世间成成事，不不求其绝绝对圆满满，留一一份不足足，可得得无限完完美。。。08:19:3508:19:3508:19Saturday,December31,202213、不知香积寺寺，数里入云云峰。。12月-2212月-2208:19:3508:19:35December31,202214、意志坚强强的人能把把世界放在在手中像泥泥块一样任任意揉捏。。31十二二月20228:19:35上上午08:19:3512月-2215、楚楚塞塞三三湘湘接接，，荆荆门门九九派派通通。。。。。十二二月月228:19上上午午12月月-2208:19December31,202216、少年十十五二十十时，步步行夺得得胡马骑骑。。2022/12/318:19:3508:19:3531December202217、空山新新雨后，，天气晚晚来秋。。。8:19:35上午午8:19上午午08:19:3512月-229、杨柳柳散和和风，，青山山澹吾吾虑。。。12月月-2212月月-22Saturday,December31,202210、阅读一切切好书如同同和过去最最杰出的人人谈话。08:19:3508:19:3508:1912/31/20228:19:35AM11、越越是是没没有有本本领领的的就就