课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段学习目标1．尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作。2．理解PCR的原理和反应过程。3．讨论PCR的应用。基础知识（一）DNA分子的结构1、DNA分子的基本组成单位？2、脱氧核苷酸的结构模式:

脱氧核糖核苷酸（简称脱氧核苷酸）3、多脱氧核苷酸链的结构模式:

DNA的羟基(-OH)末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。4.DNA分子的双螺旋结构⑴.DNA分子是由

的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则

结构。⑵.

与

交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；

排列在链的内侧。⑶.两条链上的碱基通过

连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与

配对，

一定同胞嘧啶配对。双螺旋两条反向平行脱氧核糖磷酸碱基氢键胸腺嘧啶鸟嘌呤5.DNA的复制(2)时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。(3)场所细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。(1)概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。(4)基本条件酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四种脱氧核苷酸模板:DNA的两条链⑴.边解旋边复制(过程）5.复制特点⑵.半保留复制（结果）6.遵循原则：碱基互补配对原则7.精确复制的原因8.复制的意义DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性⑴规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板⑵碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行胞内DNA分子复制的条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶打开DNA双链（需要能量）DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物（RNA）使DNA聚合酶能够从引物的3′

端开始连接脱氧核苷酸（二）PCR原理请阅读《教材》P58内容，分析：1.DNA复制需要哪些基本条件？它们分别起什么作用？3.DNA聚合酶的作用有何特性？2.什么是引物？若要克隆DNA，需要加入几种特定的引物？5.

在生物体外如何将DNA的双螺旋打开？4.为什么DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸？6.高温能将将DNA的双螺旋打开，但同时也可能使DNA聚合酶失活，怎么办？1、DNA复制需要哪些基本条件？它们分别起什么作用？解旋酶：打开DNA双链；DNA母链：提供DNA复制的模板；4种脱氧核苷酸：合成子链的原料；DNA聚合酶：催化合成DNA子链；引物：使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。3、DNA聚合酶的作用有何特性？DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。2、什么是引物？若要克隆DNA，需要加入几种特定的引物？

引物是指能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的一小段DNA或RNA片段。克隆DNA时应加入两种引物。4.为什么DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸？

DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3’端开始延伸DNA链。5、

在生物体外如何将DNA的双螺旋打开？DNA的热变性原理：在80-1000C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程就称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这称为复性。PCR就是利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。6、

高温能将将DNA的双螺旋打开，但同时也可能使DNA聚合酶失活，怎么办？

耐高温的TaqDNA聚合酶的发现和应用解决了以上矛盾。二、PCR(多聚酶链式反应）2.DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。3.DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。1.定义：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。3′5′5′3′4.PCR原理⑴.在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。⑵.当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。这个过程称为复性⑶.PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。5.TaqDNA聚合酶的应用6.需要为PCR反应提供的物质缓冲液、DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等特点。7.PCR技术的特点：8.细胞内和细胞外DNA复制环境的区别体内DNA的复制PCR模板(母链)引物原料聚合酶反应环境解链复制特点复制次数细胞内源引物合成酶合成RNA细胞内的环境细胞内源细胞内源外源加入缓冲液外源加入DNA或RNA外源加入耐高温TaP聚合酶DNA解旋酶高温变性边解旋边复制迅速扩增按细胞需要人为设定1、PCR仪㈠.设备及用具自动调控温度的仪器二.PCR的实验操作2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。1.准备2.移液㈡.实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。3.混合⑴过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4.离心⑵离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。5.反应循环数变性复性延伸第一次94℃，10min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸.⑴.变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。⑵.复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。⑶.延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。靶序列靶序列PCR循环第一步：高温变性靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与靶序列退火靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸靶序列靶序列第1个PCR循环完成后：得到两个靶序列PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6.注意事项⑴隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；⑵分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头㈠.理论上DNA扩增数目的计算三.课题成果评价1.一条DNA，复制n次，DNA为2n2.a条DNA，复制n次，DNA为a×2n㈡.实验中DNA含量的测定1.原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。2.过程⑴.稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释.⑵.对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值⑶.测定⑷.计算DNA含量(g)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数50：1g/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02光吸收波长／nm2602402202800.10.2实验小结PCR仪加热使（）变性,复性使引物与模板DNA（）,延伸需将反应温度升至中温(),在（）的作用下,以（