菌种鉴定实验过程

生土生土生工生物工程（上海）股份有限公司5刊ngondioterhfSh刊ngh君i）Uo“Ltd+菌种鉴定实验过程一、仪器与试剂1、仪器仪器名称仪器来源型号测序仪AppliedBiosystems3730XLDNA电泳槽北京六一仪器厂DYCP-31DN稳压电泳仪北京六一仪器厂DYY-5电热恒温水槽上海一恒科学仪器有限公司DK-8D凝胶成像仪上海复日科技仪器有限公司FR980恒温培养箱太仓市科教器材厂DHP-9162恒温摇床太仓市实验设备厂TH2-CPCR仪AppliedBiosystems2720thermalcycler冷冻咼速离心机BBIHC-2518RSurf系列精密单道可调移液器牛工SP10-10001.试剂试剂名称试剂来源cat.No.Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒牛工SK8255Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒牛工SK8259Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒牛工SK8257DreamTaq-TMDNAPolymeraseMBIEP0702dNTP牛工D0056琼脂糖BBIAB0014SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒牛工SK8131DNALadderMixmaker牛工SM0337引物牛工合成部合成枪头、PCR管、离心管等牛工铸塑部生产克隆测序用pMD®8-TVector连接试剂盒TakaraD101ASanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒牛工SK8191二、实验过程1、基因组DNA提取按SK8255（细菌）、SK8259（真菌）、SK8257（酵母）试剂盒操作。2、PCR扩增2・1菌种鉴定通用引物：所属类别名称序列5'一3'扩增序列PCR长度/bp细菌7F1540RCAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA16SrDNA1500bp左右27F1492RAGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT16SrDNA1500bp左右真菌ITS1ITS4TCCGTAGGTGAACCTGCGGTCCTCCGCTTATTGATATGC内转录间隔区1和2600bp左右NS1NS6GTAGTCATATGCTTGTCTCGCATCACAGACCTGTTATTGCCTC18SrDNA1300bp左右

2.2PCR反应体系:试剂体积（m）Template(基因组DNA20-50ng/gl)0.510xBuffer(withMg2+)2.5dNTP(各2.5mM)1酶0.2F(10uM)0.5R(10uM)0.5加双蒸h2o至252.3PCR循环条件：温度时间程序94°C4min预变性94°C45sec30cycle55C45sec72C1min72C10min修复延伸4Cg终止反应3、凝胶电泳1%琼脂糖电泳，150V、100mA20min电泳观察（见电泳图DNALadderMixmake）。16SrDNA18SrDNA ITS 26S”灿［】t5U(MJsoooSL-CK1KODOiat»j”灿［】t5U(MJsoooSL-CK1KODOiat»jsaci加o?aacon■?ao4、纯化回收PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，纯化方式见附见说明书（SK8131）,PCR产物用PCR引物直接测序。如需要做克隆测序需要进行下面的步骤：5、连接按TakarapMD®8-TVector连接试剂盒操作。6、感受态细胞的制备：（氯化钙法）6.1从于37°C培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100mlLB培养基的1L烧瓶中。于37C剧烈振摇培养3小时（旋转摇床，300转/分）。

生土生工生物工程（上海）股份有限公司生土5刊npondioterhfSh刊ngh君i）Uo“Ltd+6.2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0°C。6.3于4C,以4000转/分离心10分钟，回收细胞。6.4倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。6.5以10ml用冰预冷的0.1mol/LCaC12重悬每份沉淀，放置于冰浴上。6.6于4C,,以4000转/分离心10分钟，回收细胞。6.7倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。6.8每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2（含20%甘油）重悬每份细胞沉淀。6.9将细胞分装成小份（100卩"支），放于-70C冻存。7、 连接产物转化7.1取100山感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。7.2加入10山连接液，轻轻混匀。冰上放置30分钟。7.342C水浴热激90秒。冰上放置15~20分钟。7.4加400plLB培养基，37C200〜250rpm振荡培养1小时。7.5用枪头吸取200山培养菌液，涂布在预先用20山100mMIPTG和100山20mg/mlX-gal涂布的氨苄青霉素平板上。7.6平板在37C下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。8、 蓝白斑筛选当外源DNA片段插入到pUC57中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物卩-半乳糖苷酶片段的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色，选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落，9、 质粒提取与测序用M13+_引物扩增（体系如上）。.M13+/-引物测序三、测序结果分析16SrDNA序列在核糖体数据库/index.jsp上比对；比对结果范例：domainBacteria(0/20/1186838)(界)Q phylum"Actinobacteria"(0/20/176308)(门)□□□□□□classActinobacteria(0/20/176308)(纲)subclassActinobacteridae(0/20/167455)(亚纲)orderActinomycetales(0/20/166237) (目)suborderStreptomycineae(0/20/10027)(亚目)familyStreptomycetaceae(0/20/10027)(科)genusStreptomyces(0/20/9681)(属)S0006916244notcalculated0.9951242Streptomyces