基因工程第章核酸操作的基本技术

第三章核酸操作的基本技术

3.1碱抽提法提取DNA碱变性抽提法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，是当今分子生物学研究中的常规方法。碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值达到12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节其Ph至中性时，变性的质粒ＤＮＡ又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体ＤＮＡ不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体ＤＮＡ与不稳定的大分子ＲＮＡ、蛋白质－ＳＤＳ复合物等一起沉淀下来而被除去。碱变性抽提质粒ＤＮＡ，除了菌体培养、质粒扩增和收集菌体外，其提取过程大体分为三个步骤：（１）从染色体ＤＮＡ中分离质粒ＤＮＡ。（２）去除质粒ＤＮＡ中的ＲＮＡ。（３）进一步纯化质粒ＤＮＡ，去除蛋白质等杂质。3.1.1碱抽提法所用各类试剂的生化作用（１）溶菌液中的溶菌酶是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的Ｂ－１，４糖苷键，因而具有溶菌作用。（２）NaOH-SDS液：核酸在pH５.９的溶液中是稳定的，但当pH>１２或pH<３时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。ＳＤＳ是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合成为Ｒ－Ｏ－ＳＯ－３…R+－蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是ＳＤＳ能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止它影响Raase的活性。（３）ＮaＡc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。目的是把pH12.6的抽提液调节至中性，使变性的质粒ＤＮＡ能够复性，并能稳定存在。而高盐的３mol/LNaAc有利于变性的大分子染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、以及ＳＤＳ－蛋白复合物的凝聚而沉淀之。（４）乙醇：ＤＮＡ溶液是ＤＮＡ以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去ＤＮＡ周围的水分子，ＤＮＡ失水而易于聚合。一般实验中，是加２倍体积的无水乙醇与ＤＮＡ相聚合，其乙醇的最终含量占６７％左右。（５）ＴＥ缓冲液：在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑ＤＮＡ的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。采用Tris-HCL的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存ＤＮＡ时，大都采用Tris-HCL系统，而ＴＥ缓冲液中的ＥＤＴＡ更能稳定ＤＮＡ的活性。（６）酚－氯仿：酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的ＤＮＡ分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。（７）异戊醇：在抽提ＤＮＡ时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止分子相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中泡沫的产生。一般采用氯仿与异戊醇之比为２４：１。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为２５：２４：１。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。（８）饱和和酚：因为为酚与水有有一定的互互溶，苯酚酚用水饱和和的目的是是使其抽提提ＤＮＡ过过程中，不不致吸收样样品中含有有ＤＮＡ的的水分，减减少ＤＮＡＡ的损失。。用Ｔris调节pH为８是是因为ＤＮＮＡ在此条条件下比较较稳定。质粒DNA的小规模模提取－碱碱裂解法1）接种一一单菌落于于3ml含含70μl/mlAmp的的LB液体体培养基中中。200转/分37℃振荡荡培养过夜夜（约8－－10h））。12000rpm离心1min收收集细菌。。2）用STE重悬细细菌沉淀，，12000rpm离心5min，弃弃上清。3）将细菌菌沉淀重悬悬于100μl冰预预冷的溶液液I中，加加入200μl新配配制的溶液液II，温温和转动使使之混匀，，冰浴2min。4）加入150μl溶液III，将管管倒置摇荡荡1min，冰浴5min。。质粒DNA提取溶液液Ⅰ：50mM葡萄糖糖，25mMTris.Cl（pH8.0）），10mMEDTA（pH8.0），高压压灭菌，4℃保存。。质粒DNA提取溶液液Ⅱ：0.2MNaOH，1%SDS，现配现现用。质粒DNA提取溶液液Ⅲ：5M乙乙酸钾溶液液60ml，冰乙酸酸11.5ml，灭灭菌水28.5ml。5）12000rpm离心8min，，小心取上上清于离心心管中。加加等体积酚酚：氯仿抽抽提一次。。6）取上清清液加入1/5体积积5M的乙乙酸胺，再再加入2倍倍体积无水水乙醇，12000rpm离离心5min，弃上清清，加入70％乙醇醇沉淀。7）离心弃弃上清，真真空抽干，，去除痕量量乙醇。8）加入50μlTE并加加入1μlRNase放入入37℃水水浴1h。。9）0.7%琼脂糖糖电泳检测测其含量。。3.1.2碱碱抽提提法抽提DNA过程中应应注意的问题题（1）染色色体DNA、、蛋白质与RNA是否去去除干净，是是否获得一定定得率的质粒粒DNA。（2）所用器器皿必须严格格清洗，各种种试剂配制是是否准确，有有的需高压高高温灭菌。（3）加乙醇醇沉淀DNA时，要把离离心管加盖摇摇动4-5次次，注意观察察水相与乙醇醇之间没有有分层现象之之后，才可以以放入冰箱中中沉淀DNA。3.2DNA提取的的其他方法2.2.1质质粒DNA的分离纯纯化2.2.1.1微量提取取质粒ＤＮＡＡ小规模制备质质粒ＤＮＡ的的特点是可以以一次制备多多种质粒ＤＮＮＡ，速度快快、省时间、、步骤简化、、ＤＮＡ纯度度好，可以用用于酶切、连连接，甚至多多纯化几次还还可作双链ＤＤＮＡ序列分分析的模板等等常规基因工工程操作之用用。主要有下下列方法：有煮沸法、９９６孔微量滴滴定板法、碱碱变性ＳＤＳＳ和和ＳＥＴＴ法、单链质质粒ＤＮＡ的的小量制备法法、不需要苯苯酚抽提的质质粒ＤＮＡ的的小量制备和和用商品化试试剂盒制备质质粒ＤＮＡ等等。3.2.1质质粒ＤＤＮＡ的大量量制备在制作酶谱、、测定序列、、制备探针等等实验中需要要高纯度、高高浓度的质粒粒ＤＮＡ，为为此需要大量量提取质粒ＤＤＮＡ。大量量提取的质粒粒ＤＮＡ一般般需进一步纯纯化，常用柱柱层析法和氯氯化铯梯度离离心法。ＤＮＮＡ的抽提方方法主要有：：煮沸裂解法法、ＳＤＳ裂裂解法、Triton裂裂解法和Wizard大大量ＤＮＡ纯纯化系统等。。质粒DNA的的大量制备1）接种含含有目的片段段的单菌落于于100ml液体LB培培养基中，37℃培养过过夜。4000rpm，，4℃离心10min，收收集菌体。2）将细菌沉沉淀用20ml冰预冷的的STE溶液液重悬，按上上述方法重新新离心，去上上清，倒置，，用吸水纸吸干干残留液，加加入冰预冷溶溶液Ⅰ2ml，将细菌菌沉淀重悬。。3）加200μl新配制制的溶菌酶溶溶液(10mg/ml溶溶于10mMTris·Cl，pH8.0)，混匀。4）加入4ml新配制的的溶液Ⅱ，缓缓慢颠倒数次次，充分混匀匀内容物，于于室温放置5-10min。5）加2ml用冰预冷的的溶液Ⅲ，将将离心管颠倒倒数次，冰浴浴15min。12000rpm，，4℃离心20min。。6）将上清转转移至另一离离心管中，加加0.6倍体体积异丙醇，，充分混匀，，于室温放置置10min。10000rpm，室温温离心15min，回收收质粒沉淀。。7）去除上上清，用70%乙醇洗沉沉淀一次，稍稍抽干，溶于于1mlTE中。8）加入5μμlRNaseA（（5mg/ml），37℃消化1hr。9）转移至小小离心管，用用等体积的苯苯酚，苯酚∶∶氯仿，氯仿仿，各抽提一一次。10）加入1/5体积的的10MNH4AC，再加入入2倍体积的的无水乙醇，，混匀，室温温放置30min。12000rpm，室温离离心10min。11）弃上清清，70%乙乙醇洗沉淀两两次，真空抽抽干，溶于适适量TE中，，储存于-20℃。3.2.2质质粒ＤＮＮＡ的纯化１、聚乙二醇醇沉淀法纯化化质粒ＤＮＡＡ２、氯化铯－－溴化乙锭梯梯度平衡离心心法纯化闭环环ＤＮＡ３、从质粒ＤＤＮＡ制品中中去除ＲＮＡＡ（１）通过１１mol/LNaCl进行离心（２）通过Bio-GelA-150m或SepharoseCL-4B进进行层析3.2.3基基因组组或其他ＤＮＮＡ的抽提2.2.2.1细菌基基因组ＤＮＡＡ的制备以微量制备法法为例：１、５ml细细菌培养液生生长至对数生生长期。取1.5ml转转入小离心管管中离心２min.2、用567ulＴＥ缓缓冲液重新悬悬浮沉淀，加加入30ul的１０％的的ＳＤＳ和和3ul的20mg/ml蛋蛋白酶Ｋ，，混合。在３３７℃下保温温１h。３、加入100ul的５５mol/LNaCl，完全混合合，再加入80ulCTAB-NaCl溶液，，混合。在65℃下保保温10min。(CTAB,十六烷基三甲甲基溴化铵)４、加入等体体积的酚－氯氯仿－异戊醇醇，混合。离离心４－５min，将上上清液转移至至一新的离心心管中。５、按上述步步骤重复抽提提。将上清液液转移至一新新的离心管中中。６、加入0.6倍体积的的异丙醇，轻轻轻混合直至至ＤＮＡ沉淀淀。用70%乙醇洗一下下沉淀。离心心５min，，弃去上清液液后真空干燥燥。用100ulＴＥ缓缓冲液重新悬悬浮ＤＮＡ。。3.2.4哺哺乳动动物细胞基因因组ＤＮＡ的的抽提哺乳动物基因因组DNA通通常先用SDS等裂解,再用苯酚抽抽提进行分离离。用这类方方法产生的DNA长度（（100-150kb））适用于Southern分析和用用λ噬菌体构建基基因组文库。。1、哺乳动物物组织细胞的的DNA提取取组织样保存在在70%乙醇醇中，－20℃冻存。提提取ＤＮＡ时时组织样需研研碎，乙醇挥挥发掉，提取取方法同质粒粒的ＤＮＡ提提取法。2、哺乳动物物血液基因组组DNA的提提取（1）取750ul冻存存血加入等量量PBS，混混合均匀（2）12000rpm离心5分钟钟，弃上清（3）加入450ulDNA提取取buffer,重悬沉沉淀（4）加入Rnase至至终浓度20ug/ml，37℃温温育1小时(5)加入蛋蛋白酶K至终终浓度100ug/ml,混匀，55℃水浴消消化过夜(6)加入等等体积Ｔris饱合酚，，温和摇动10分钟，12000rpm离心５５分钟(7)将上上层水相转移移至另一干净净离心管(8)再加加入等体积酚酚：氯仿和氯氯仿，各抽提提一次(9)上层水水相用1/5体积乙酸钠钠和２倍体积积无水乙醇沉沉淀ＤＮＡ(10)12000rpm离心10分钟，收集集沉淀，70％乙醇洗沉沉淀(11)真空空抽干，用适适量TE（pH8.0））溶解ＤＮＡＡ2.2.5从从植物中中分离基因组组DNA从植物中分离离高产量和高高质量DNA不是一件容容易的事。由由于细胞壁及及植物特有的的细胞内物质质，需要用较较特殊的处理理方法。1、用CTAB抽提植物物DNA（1）将组织织放入离心管管中，加入5倍体积的抽抽提缓冲液，，再加入一些些洗过的灭菌菌海沙于-20℃冷冻。。（2）用杵将将组织压软，，置组织于液液氮中磨碎。。（3）短暂振振荡，于65℃温浴5min。（4）加1倍倍体积的氯仿仿-异戊醇混混合物，轻轻轻颠倒几次使使之混匀。离离心5min,将上层水水相转移到另另一管中。（5）加1倍倍体积的溴化化乙锭液，1倍体积苯酚酚和1倍体积积氯仿，轻轻轻混匀。离心心取上清。溴溴化乙锭可帮帮助除去多糖糖。大多数植植物组织可省省去这一步。。（6）加1/10体积的的3mol/L醋酸钠和和1倍体积异异丙醇，于-20℃放置置30min或过夜，沉沉淀DNA。。（7）以12000r/min离心心10min，倒掉上清清。（8）加0.5ml冷的的70%乙醇醇，重悬沉淀淀，离心2min。（9）真空或或37℃放置置10min，干燥DNA。（10）适量量TE溶解DNA。3.3DNA的定定量和纯度测测定对于基因操作作中的载体DNA和外源源目的DNA片段，必须须对其浓度、、纯度、构型型、相对分子子量大小等基基本情况进行行了解。有时时DNA中含含有酚类和多多糖类物质会会影响酶切和和PCR的效效果，尤其DNA浓度是是一个非常关关键的因素。。3.3.1紫紫外光谱谱分析法紫外光谱分析析法的原理基基于DNA（（RNA）分分子在260nm处有特特异的紫外吸吸收峰且吸收收强度与系统统中DNA或或RNA的浓浓度成正比。。该法的特点点是准确、简简便，但所需需仪器较昂贵贵。由于测定OD260时，难以排除除RNA、染染色体DNA、以及解链链的增色效应应的因素，因因此测得的数数据往往比实实际浓度偏高高。衡量所提取DNA的纯度度可用OD260与OD280的比值。OD260/OD280对DNA而言言其值大约为为1.8，高高于1.8则则可能有RNA污染，低低于1.8则则有蛋白质的的污染。在260nm的读数用用于计算样品品中核酸的浓浓度,OD值值为1相当于于大约50ug/ml双双链DNA、、40ug/ml单链DNA或RNA以及大约约20ug/ml的单链链寡核苷酸。。EB荧光分析析法EB（溴化化乙锭），，一种荧光光染料，它它能插入DNA或RNA的碱碱基对平面面之间而结结合于其上上。一旦EB结合在在DNA分分子上，它它能在紫外外光的激发发下产生桔桔黄色荧光光。这种方方法的优点点是简便易易行、经济济，并且与与凝胶电泳泳相结合可可以分析DNA样品品是否完整整等，缺点点是准确性性较低。9、静夜四无邻邻，荒居旧业业贫。。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、雨中黄叶叶树，灯下下白头人。。。11:16:5411:16:5411:1612/29/202211:16:54AM11、以我独沈久久，愧君相见见频。。12月-2211:16:5411:16Dec-2229-Dec-2212、故人江海别别，几度隔山山川。。11:16:5411:16:5411:16Thursday,December29,202213、乍见翻疑疑梦，相悲悲各问年。。。12月-2212月-2211:16:5411:16:54December29,202214、他乡生白白发，旧国国见青山。。。29十二二月202211:16:54上上午11:16:5412月-2215、比不了得就就不比，得不不到的就不要要。。。十二月2211:16上上午12月-2211:16December29,202216、行动出成果果，工作出财财富。。2022/12/2911:16:5411:16:5429December202217、做前，能够够环视四周；；做时，你只只能或者最好好沿着以脚为为起点的射线线向前。。11:16:54上午午11:16上上午11:16:5412月-229、没有失败败，只有暂暂时停止成成功！。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、很多事情努努力了未必有有结果，但是是不努力却什什么改变也没没有。。11:16:5411:16:5411:1612/29/202211:16:54AM11、成功就是日日复一日那一一点点小小努努力的积累。。。12月-2211:16:5411:16Dec-2229-Dec-2212、世间成事，，不求其绝对对圆满，留一一份不足，可可得无限完美美。。11:16:5411:16:5411:16Thursday,December29,202213、不知香积积寺，数里里入云峰。。。12月-2212月-2211:16:5411:16:54December29,202214、意志坚强强的人能把把世界放在在手中像泥泥块一样任任意揉捏。。29十二二月202211:16:55上上午11:16:5512月-2215、楚塞三湘接接，荆门九派派通。。。十二月2211:16上上午12月-2211:16December29,202216、少年十五五二十时，，步行夺得得胡马骑。。。2022/12/2911:16:5511:16:5529December202217、空山新雨后后，天气晚来来秋。