蛋白质的水解(同名308)课件

第三章

蛋白质生工082班第三章生工082班1第三章蛋白质(protein)

1蛋白质的概念存在于所有的生物细胞中，是由20种α－氨基酸按一定的序列通过酰胺键（蛋白质化学中称为肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。相对分子质量由数千到数千万。第三章蛋白质(protein)

1蛋白质的概念存2第三章蛋白质(protein)

(123-317页第3，4，5，6，7章)第一节氨基酸—蛋白质的构件分子第二节蛋白质通论与结构第三节蛋白质结构与功能的关系第四节蛋白质的性质、分离与纯化1第三章蛋白质(protein)

(123-317页3第一节氨基酸—蛋白质的构件分子水解类型使用试剂优点缺点酸水解H2SO4(4M)或HCl(6M),

20h无消旋作用色氨酸被破坏，部分丝氨酸、苏氨酸水解，天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺基碱水解NaOH(5M)10-20h色氨酸稳定酶水解蛋白酶无消旋作用，aa不被破坏不完全水解，需多种酶协同作用完全水解完全水解：混合的氨基酸部分水解：肽段和氨基酸大多数aa被破坏，有消旋作用，产物为D-和L-氨基酸混合物；精氨酸脱氨（一）蛋白质的水解第一节氨基酸—蛋白质的构件分子水解类型使用试剂优点缺点酸4（二）氨基酸的分类1、根据侧链R基团是否有极性非极性氨基酸Ala、Val、Ile、Pro、Phe、Trp、Met极性氨基酸不带电极性：GlySerThrCysTyrAsnGln带负电：AspGlu带正电：LysArgHis2、根据分子中氨基与羧基数目酸性氨基酸：AspGlu碱性氨基酸：LysHisArg中性氨基酸：15种3、根据人和哺乳动物所需氨基酸是否能自身合成必需氨基酸：LysValMetTryLeuIleThrPhe半必需：ArgHis非必需：其余10种不常见的氨基酸：4-羟基脯氨酸5-羟基赖氨酸（由常见的氨基酸经修饰而来的）非蛋白质氨基酸：150余种20种组成蛋白质的氨基酸均为L-型（二）氨基酸的分类20种组成蛋白质的氨基酸均为L-型5特殊氨基酸的总结唯一一个无手性碳、无旋光性的氨基酸：Gly唯一一个亚氨基酸、与茚三酮反应生成黄色物质的氨基酸：Pro含有巯基，在空气中易氧化生成二硫键的氨基酸：Cys在生物合成中是一种重要甲基供体的氨基酸：Met在大多数酶的活性中心都发现有其残基的氨基酸：Ser在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸：His碱性最强、在生理条件下完全质子化的氨基酸：Arg含有两个手性碳的氨基酸：ThrIle在近紫外区有吸收的氨基酸：TrpTyrPhe

能够发生Millon反应的氨基酸：Trp能够发生Pauly反应的氨基酸：His能够发生坂口反应的氨基酸：Arg蛋白质的水解(同名308)课件6（三）氨基酸的酸碱化学aa在晶体或水中以兼性离子形式存在等电点：在溶液某一特定pH值时，氨基酸主要以两性离子形式存在，净电荷为零，在电场中不向电场的正极或负极移动，这时的溶液pH值称为该氨基酸的等电点。当溶液pH低于该氨基酸等电点时，氨基酸净电荷为正，反之为负。氨基酸在等电点时溶解度最低．不同氨基酸等电点不同．应用

根据氨基酸的电荷不同（电泳法,离子交换层析）分离混合物。根据氨基酸的等电点不同（调节溶液pH）分离混合物。Handerson-Hasselbalch公式pH=pKa+lg（[A-]/[HA]）=pKa+lg（[碱]/[酸]）

（三）氨基酸的酸碱化学7等电点的计算1.侧链不解离的中性氨基酸

pI=(

pK1+pK2

)/2

2.侧链含有可解离基团的氨基酸酸性氨基酸pI=(

pK1+pKR2

)/2碱性氨基酸

pI=(

pK2+pKR3

)/2半胱氨酸pI=(

pK1+pKR2

)/2酪氨酸pI=(

pK1+pKR2

)/2注意：pKa的数值选公式中代入的质子供体和质子受体之间的解离子数。等电点的计算1.侧链不解离的中性氨基酸8（四）氨基酸的化学反应

1.α-氨基参加的反应与亚硝酸反应与酰化试剂反应烃基化反应生成西佛碱的反应脱氨基反应与转氨基反应2,4－二硝基氟苯（DNFB或FDNB，Sanger试剂）苯异硫氰酸酯（PITC，Edman试剂）

用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸及序列测定（四）氨基酸的化学反应92.α-氨基和α-羧基共同参加的反应（1）与茚三酮的反应（2）氨基酸的两性解离（3）形成肽键（4）离子交换反应茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，所有具有游离氨基氨基酸都生成紫色化合物（570）。脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应直接生成的是黄色化合物（440）。应用：是一个检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。用层析法把各种氨基酸分开后，利用茚三酮显色可以定性测定各种氨基酸。2.α-氨基和α-羧基共同参加的反应103.侧链R基参加的反应(1)酪氨酸的酚基

米伦反应（Millon)与HgNO3、Hg（NO3)2、HNO3作用呈红色；与浓硝酸作用生成黄色。Pauly反应与重氮化合物反应生成橘黄色化合物。注：His的咪唑基与重氮化合物反应生成棕红色（2）精氨酸的胍基坂口反应（Sagakuchi）与次氯酸钠(或次溴酸钠)及α-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物。3.侧链R基参加的反应11（3）Cys侧链上的巯基（－SH）与卤化烷生成稳定的烷基衍生物------可保护-SH以防被氧化Cys巯基打开氮丙啶的环巯基能和各种金属离子形成络合物----SH酶遇到重金属离子而生成硫醇盐时，将导致酶失活巯基易受空气或其他氧化剂氧化－两种氧化衍生物形成二硫化物：胱氨酸的形成形成磺酸基：对游离的巯基具有保护作用，保护Cly巯基之间的氧化。（3）Cys侧链上的巯基（－SH）12二硫键的还原（打开）

①氧化剂：过甲酸（HCOOOH）②还原剂：巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇等。二硫键的还原（打开）13

（五）氨基酸的光学活性和光谱性质氨基酸的旋光性氨基酸的光谱性质在280nm处有最大吸收峰可见光区都没有光吸收在远紫外区和红外区都有光吸收近紫外区(220~400nm)只有酪氨酸(275nm)苯丙氨酸(257nm)和色氨酸(280nm)有吸收。这是紫外吸收法测定蛋白质含量的基础。（五）氨基酸的光学活性和光谱性质14（六）氨基酸混合物的分离和分析分配层析法的一般原理纸层析柱层析离子交换层析气液层析薄层层析高效(压)液相层析HPLC（六）氨基酸混合物的分离和分析15二、蛋白质通论与结构（一）蛋白质通论1.化学组成：C、H、O、N、P、S蛋白质系数：1g氮所代表的蛋白质g数。是凯氏定氮法测蛋白质含量的计算基础2.蛋白质的生理功能：要点构成生物体的基本成分；具有多种多样的生物功能（二）.蛋白质结构1、肽2、蛋白质的一级结构3、蛋白质的构象二级结构超二级结构和结构域三级结构四级结构二、蛋白质通论与结构（一）蛋白质通论16（三）肽一分子氨基酸的α-羧基与另一分子氨基酸α-氨基脱水缩合的化合物叫做肽．肽是氨基酸的线性聚合物。肽键的特点具有部分双键特性，不能自由旋转,呈现相对的刚性和平面化。肽键的亚氨基没有明显的解离和质子化。除脯氨酸外多以反式结构存在。肽的化学反应多肽链的水解：酸水解、碱水解、酶水解具有旋光性颜色反应紫外吸收天然存在的重要多肽以蛋白质形式存在:以天然活性肽形式存在：生物活性肽（三）肽17（四）一级结构一级结构：指蛋白质分子中氨基酸的组成、排列顺序、连接方式以及多肽链的数目和关联。（主要为肽键，包括二硫键）是蛋白质空间结构和生理功能的基础。蛋白质一级结构的测定要求样品必须是均一的。纯度在>97%以上知道蛋白质的分子量步骤（待测样品分成多份分别进行各步骤测定）测定蛋白质分子中多肽链的数目拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键分析每一多肽链的氨基酸组成测定并确定多肽链的氨基酸序列确定原多肽链中二硫键的位置（四）一级结构18（五）蛋白质的构象蛋白质的构象指蛋白质的所有原子在三维空间的位置，即蛋白质的空间结构一、研究蛋白质构象的方法1.应用间接的X射线衍射法（技术）2.研究溶液中蛋白质构象的光谱学法二、稳定蛋白质三维结构的作用力非共价键：氢键、疏水相互作用力、范德华力、盐键共价键：二硫键三、蛋白质天然折叠结构决定因素与溶剂分子的相互作用溶剂的pH和离子组成多肽主链折叠的空间限制。蛋白质的氨基酸序列四、蛋白质的二、三、四级结构（五）蛋白质的构象19二级结构指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。维系力：链内或链间形成的氢键。由R基的短程顺序决定。主要有-螺旋、-折叠、-转角。几种纤维状蛋白质

-角蛋白-角蛋白胶原蛋白肌球蛋白与肌动蛋白二级结构20超二级结构和结构域超二级结构：是指蛋白质中相邻的二级单元（即α－螺旋、β－折叠和β－转角等）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。模体（Motif,超二级结构）

常见的3种基本组合形式：αα、βαβ、ββ结构域：对于较大的蛋白质分子（或亚基），多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体就称结构域。存在于一条肽链内。铰链区功能域结构域的生物学意义相当多的结构域都具有局部而不完全的功能。结构域的间隙部位往往是蛋白质的功能部位，而且不同的间隙可以表现不同的功能。多结构域蛋白质的活性是不同结构域的活性的总和，但绝不是机械的加和。结构域的相互作用会导致整个蛋白质分子的变构效应超二级结构和结构域21三级结构三级结构：是建立在二级结构、超二级结构乃至结构域的基础上的，多肽链进一步折叠卷曲形成复杂的球状分子结构，称为三级结构。维系力：有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。由氨基酸的长程顺序决定球状蛋白质三维结构的特点1.分子内各种侧链基团相互作用的结果2.含有多种二级结构单元3.一般疏水侧链埋藏在分子内部（疏水核），亲水侧链暴露在分子表面。4.分子的表面多有空穴（凹槽）三级结构22亚基缔合与四级结构是指寡聚蛋白中亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布和亚基间的相互作用。亚基:寡聚蛋白中的每个独立三级结构单元称为,一般由一条肽链构成，无生理活性。若为二条肽链，则之间以二硫键相连。维系力：疏水相互作用、范德华力、盐键。亚基相互作用的方式①按亚基的种类：同源多聚体：异源多聚体：②按亚基的数目：低聚体：多聚体：四级结构的对称性①环状对称系统②二面对称系统③立方体对称系统亚基缔合与四级结构23谢谢谢谢24

第三章

蛋白质生工082班第三章生工082班25第三章蛋白质(protein)

1蛋白质的概念存在于所有的生物细胞中，是由20种α－氨基酸按一定的序列通过酰胺键（蛋白质化学中称为肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。相对分子质量由数千到数千万。第三章蛋白质(protein)

1蛋白质的概念存26第三章蛋白质(protein)

(123-317页第3，4，5，6，7章)第一节氨基酸—蛋白质的构件分子第二节蛋白质通论与结构第三节蛋白质结构与功能的关系第四节蛋白质的性质、分离与纯化1第三章蛋白质(protein)

(123-317页27第一节氨基酸—蛋白质的构件分子水解类型使用试剂优点缺点酸水解H2SO4(4M)或HCl(6M),

20h无消旋作用色氨酸被破坏，部分丝氨酸、苏氨酸水解，天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺基碱水解NaOH(5M)10-20h色氨酸稳定酶水解蛋白酶无消旋作用，aa不被破坏不完全水解，需多种酶协同作用完全水解完全水解：混合的氨基酸部分水解：肽段和氨基酸大多数aa被破坏，有消旋作用，产物为D-和L-氨基酸混合物；精氨酸脱氨（一）蛋白质的水解第一节氨基酸—蛋白质的构件分子水解类型使用试剂优点缺点酸28（二）氨基酸的分类1、根据侧链R基团是否有极性非极性氨基酸Ala、Val、Ile、Pro、Phe、Trp、Met极性氨基酸不带电极性：GlySerThrCysTyrAsnGln带负电：AspGlu带正电：LysArgHis2、根据分子中氨基与羧基数目酸性氨基酸：AspGlu碱性氨基酸：LysHisArg中性氨基酸：15种3、根据人和哺乳动物所需氨基酸是否能自身合成必需氨基酸：LysValMetTryLeuIleThrPhe半必需：ArgHis非必需：其余10种不常见的氨基酸：4-羟基脯氨酸5-羟基赖氨酸（由常见的氨基酸经修饰而来的）非蛋白质氨基酸：150余种20种组成蛋白质的氨基酸均为L-型（二）氨基酸的分类20种组成蛋白质的氨基酸均为L-型29特殊氨基酸的总结唯一一个无手性碳、无旋光性的氨基酸：Gly唯一一个亚氨基酸、与茚三酮反应生成黄色物质的氨基酸：Pro含有巯基，在空气中易氧化生成二硫键的氨基酸：Cys在生物合成中是一种重要甲基供体的氨基酸：Met在大多数酶的活性中心都发现有其残基的氨基酸：Ser在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸：His碱性最强、在生理条件下完全质子化的氨基酸：Arg含有两个手性碳的氨基酸：ThrIle在近紫外区有吸收的氨基酸：TrpTyrPhe

能够发生Millon反应的氨基酸：Trp能够发生Pauly反应的氨基酸：His能够发生坂口反应的氨基酸：Arg蛋白质的水解(同名308)课件30（三）氨基酸的酸碱化学aa在晶体或水中以兼性离子形式存在等电点：在溶液某一特定pH值时，氨基酸主要以两性离子形式存在，净电荷为零，在电场中不向电场的正极或负极移动，这时的溶液pH值称为该氨基酸的等电点。当溶液pH低于该氨基酸等电点时，氨基酸净电荷为正，反之为负。氨基酸在等电点时溶解度最低．不同氨基酸等电点不同．应用

根据氨基酸的电荷不同（电泳法,离子交换层析）分离混合物。根据氨基酸的等电点不同（调节溶液pH）分离混合物。Handerson-Hasselbalch公式pH=pKa+lg（[A-]/[HA]）=pKa+lg（[碱]/[酸]）

（三）氨基酸的酸碱化学31等电点的计算1.侧链不解离的中性氨基酸

pI=(

pK1+pK2

)/2

2.侧链含有可解离基团的氨基酸酸性氨基酸pI=(

pK1+pKR2

)/2碱性氨基酸

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)/2半胱氨酸pI=(

pK1+pKR2

)/2酪氨酸pI=(

pK1+pKR2

)/2注意：pKa的数值选公式中代入的质子供体和质子受体之间的解离子数。等电点的计算1.侧链不解离的中性氨基酸32（四）氨基酸的化学反应

1.α-氨基参加的反应与亚硝酸反应与酰化试剂反应烃基化反应生成西佛碱的反应脱氨基反应与转氨基反应2,4－二硝基氟苯（DNFB或FDNB，Sanger试剂）苯异硫氰酸酯（PITC，Edman试剂）

用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸及序列测定（四）氨基酸的化学反应332.α-氨基和α-羧基共同参加的反应（1）与茚三酮的反应（2）氨基酸的两性解离（3）形成肽键（4）离子交换反应茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，所有具有游离氨基氨基酸都生成紫色化合物（570）。脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应直接生成的是黄色化合物（440）。应用：是一个检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。用层析法把各种氨基酸分开后，利用茚三酮显色可以定性测定各种氨基酸。2.α-氨基和α-羧基共同参加的反应343.侧链R基参加的反应(1)酪氨酸的酚基

米伦反应（Millon)与HgNO3、Hg（NO3)2、HNO3作用呈红色；与浓硝酸作用生成黄色。Pauly反应与重氮化合物反应生成橘黄色化合物。注：His的咪唑基与重氮化合物反应生成棕红色（2）精氨酸的胍基坂口反应（Sagakuchi）与次氯酸钠(或次溴酸钠)及α-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物。3.侧链R基参加的反应35（3）Cys侧链上的巯基（－SH）与卤化烷生成稳定的烷基衍生物------可保护-SH以防被氧化Cys巯基打开氮丙啶的环巯基能和各种金属离子形成络合物----SH酶遇到重金属离子而生成硫醇盐时，将导致酶失活巯基易受空气或其他氧化剂氧化－两种氧化衍生物形成二硫化物：胱氨酸的形成形成磺酸基：对游离的巯基具有保护作用，保护Cly巯基之间的氧化。（3）Cys侧链上的巯基（－SH）36二硫键的还原（打开）

①氧化剂：过甲酸（HCOOOH）②还原剂：巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇等。二硫键的还原（打开）37

（五）氨基酸的光学活性和光谱性质氨基酸的旋光性氨基酸的光谱性质在280nm处有最大吸收峰可见光区都没有光吸收在远紫外区和红外区都有光吸收近紫外区(220~400nm)只有酪氨酸(275nm)苯丙氨酸(257nm)和色氨酸(280nm)有吸收。这是紫外吸收法测定蛋白质含量的基础。（五）氨基酸的光学活性和光谱性质38（六）氨基酸混合物的分离和分析分配层析法的一般原理纸层析柱层析离子交换层析气液层析薄层层析高效(压)液相层析HPLC（六）氨基酸混合物的分离和分析39二、蛋白质通论与结构（一）蛋白质通论1.化学组成：C、H、O、N、P、S蛋白质系数：1g氮所代表的蛋白质g数。是凯氏定氮法测蛋白质含量的计算基础2.蛋白质的生理功能：要点构成生物体的基本成分；具有多种多样的生物功能（二）.蛋白质结构1、肽2、蛋白质的一级结构3、蛋白质的构象二级结构超二级结构和结构域三级结构四级结构二、蛋白质通论与结构（一）蛋白质通论40（三）肽一分子氨基酸的α-羧基与另一分子氨基酸α-氨基脱水缩合的化合物叫做肽．肽是氨基酸的线性聚合物。肽键的特点具有部分双键特性，不能自由旋转,呈现相对的刚性和平面化。肽键的亚氨基没有明显的解离和质子化。除脯氨酸外多以反式结构存在。肽的化学反应多肽链的水解：酸水解、碱水解、酶水解具有旋光性颜色反应紫外吸收天然存在的重要多肽以蛋白质形式存在:以天然活性肽形式存在：生物活性肽（三）肽41（四）一级结构一级结构：指蛋白质分子中氨基酸的组成、排列顺序、连接方式以及多肽链的数目和关联。（主要为肽键，包括二硫键）是蛋白质空间结构和生理功能的基础。蛋白质一级结构的测定要求样品必须是均一的。纯度在>97%以上知道蛋白质的分子量步骤（待测样品分成多份分别进行各步骤测定）测定蛋白质分子中多肽链的数目拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键分析每一多肽链的氨基酸组成测定并确定多肽链的氨基酸序列确定原多肽链中二硫键的位置（四）一级结构42（五）蛋白质的构象蛋白质的构象指蛋白质的所有原子在三维空间的位置，即蛋白质的空间结构一、研究蛋白质构象的方法1.应用间接的X射线衍射法（技术）2.研究溶液中蛋白质构象的光谱学法二、稳定蛋白质三维结构的作用力非共价键：氢键、疏水相互作用力、范德华力、盐键共价键：二硫键三、蛋白质天然折叠结构决定因素与溶剂分子的相互作用溶剂的pH和离子组成多肽