生物分析与检验-糖类、脂类和核酸类药物final

第九章

糖类、脂类及核酸类药物的分析掌握几种糖类药物的含量测定方法掌握脂类药物的含量测定方法掌握核酸类药物的定性及定量方法学习目的糖类物质：是多羟基（2个或以上）的醛类或酮类化合物，在水解后能变成以上两者之一的有机化合物。在化学上，由于其由碳、氢、氧元素构成，在化学式的表现上类似于“碳”与“水”聚合，故又称之为碳水化合物。第一节糖类药物的分析生物学功能：1.提供能量。2.细胞的骨架。3.细胞间识别和生物分子间的识别。4.在生物体内转化为其他物质。人体吸收：糖包括蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、糊精等。除了葡萄糖、果糖和半乳糖能被人体直接吸收，其余的糖都要在体内转化为基本的单糖后，才能被吸收利用。

单糖：不能再水解的糖；寡糖：水解能生成2~10个单糖分子的糖；

多糖：能水解生成许多单糖的高分子化合物。糖的分类（根据其能否被水解）同多糖：由一种单糖组成的多糖；杂多糖：多种单糖或单糖衍生物组成的单糖。**一、糖及糖类药物概述（一般的糖类药物指的就是多糖）葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖单糖蔗糖乳糖

赋形剂和矫味剂双糖淀粉多糖医学上的糖类：葡萄糖属单糖，是人体能量的主要来源之一。乳糖、蔗糖，淀粉常被用作药物制剂的赋形剂或矫味剂。临床上常用多糖药物：葡萄糖、右旋糖酐、肝素、硫酸软骨素等。

一、糖及糖类药物概述糖的分类（根据其能否被水解）糖类药物的分类

糖类药物种类繁多，其分类方法也有多种，按照含有糖基数目不同可分为以下几类。（1）单糖类：如葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素C等。（2）低聚糖类：如蔗糖、麦芽乳糖、乳果糖等。（3）多糖类：（4）糖的衍生物：如1，6－二磷酸果糖、6－磷酸葡萄糖、磷酸肌醇等。多糖按其来源分为：（1）植物多糖：淀粉、纤维素、茶叶多糖、大黄多糖（2）动物多糖：肝素、硫酸软骨素、甲壳素（3）微生物多糖：香菇多糖、银耳多糖、芸芝多糖（4）人工合成多糖：人造纤维素（一般的糖类药物指的就是多糖）1.比旋度测定在一定波长与温度下，偏振光透过每1ml含有1g旋光性物质的溶液且光路为长1dm时，测得的旋光度称为比旋度，以[α]tD表示。多糖类药物均有一定的比旋度，可按药典附录比旋度测定法进行测定。二、物理常数测定示例---肝素钠取本品，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL约含40mg的溶液，依法测定，比旋度应不小于+50°肝素钠是粘多糖硫酸酯类抗凝血药。肝素钠是由猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质。比旋度可以反映其纯度，故药典不作专项含量测定，只规定比旋度范围示例---葡萄糖2.溶解度硫酸软骨素：水中易溶；乙醇、丙酮和冰醋酸中不溶二、物理常数测定粘多糖类物质，治疗关节疾病的药品，与氨基葡萄糖配合使用，具有止痛，促进软骨再生的功效三、鉴别实验1.沉淀反应取本品0.2g，加水5mL溶解后，滴入微温的碱性酒石酸铜中，生成氧化亚铜的红色沉淀。葡萄糖醛基的还原性水、△Cu2O↓

Fehling试液△CuO2↓△中和

蔗糖分子中为半缩酮基，无还原性，需酸水解后才有上述反应麦芽糖？3.高效液相色谱法供试品溶液的保留时间应与对照溶液主峰的保留时间一致。肝素钠

2.红外分光光度法中国药典规定本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。硫酸软骨素

四、杂质检查

（一）葡萄糖的检查葡萄糖的制备工艺1、酸度：目的：控制本品的酸性杂质。原因：内在：由于葡萄糖中有醛基，易被氧化成葡萄糖酸；

外在：水解过程中加入的酸。方法：取本品2.0g,加新沸过的冷蒸馏水20ml溶解后，加酚酞指示液3滴与氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）0.20ml，应显粉红色。2、溶液的澄清度与颜色目的：检查水中不溶性杂质或有色杂质。取本品5.0g，加热水溶解后，放冷，用水稀释至10ml，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（2015年版药典二部附录ⅨB）比较，不得更浓；如显色，与对照液（取比色用氯化钴液3.0ml、比色用重铬酸钾液3.0ml与比色用硫酸铜液6.0ml，加水稀释成50ml）1.0ml加水稀释至10ml比较，不得更深。3、乙醇溶液的澄清度目的：检查乙醇中不溶性杂质，如糊精。原理：糊精在热乙醇中溶解度小，使澄清度变差。方法：取本品1.0g，加90%乙醇30ml，置水浴上加热回流约10min，溶液应澄清。葡萄糖在90%沸乙醇中能完全溶解4、亚硫酸盐与可溶性淀粉原理及现象：由于部分硫酸在水解过程中被还原，可能产生亚硫酸盐，而可溶性淀粉则是未反应的原料。供试品实验结果显黄色，为合格。

5、蛋白质原理：制备葡萄糖原料多为淀粉，它来自于植物的根茎或种子，因而在提取过程中常有蛋白质被同时提出，利用蛋白质类杂质遇酸产生沉淀的性质可对其进行检查（不得发生沉淀）6、氯化物、硫酸盐、铁盐、重金属等葡萄糖氯化物左为供试管，右为标准管左管浊度低于右管合格氯化物（AgCl沉淀）供试液：本品0.30g+水→12ml+稀HNO35ml+水→20ml

+AgNO30.5ml+水→25ml，摇匀，对照液：量取标准NaCl溶液3.0ml+稀硝酸5ml+水稀释→20ml→+AgNO30.5ml+水→25ml，摇匀，暗处5min后比较→供试液不得更深葡萄糖硫酸盐右为供试管，左为标准管左管浊度高于右管合格硫酸盐（硫酸钡沉淀）供试液：本品1.0g+水→20ml对照液：量取标准K2SO41.0ml+水→20ml→+稀HCL1ml+25%BaCl22.5ml+水→25ml，摇匀，10min后比较→供试液不得更深6、氯化物、硫酸盐、铁盐、重金属等葡萄糖铁盐上管为标准管，下管为供试管上管溶液颜色深于下管合格葡萄糖重金属左管为标准管，右管为供试管左管颜色深于右管合格Fe3++6SCN-

—→

[Fe(SCN)6]3-

红色硫代乙酰胺在弱酸性(pH约3.5)溶液中水解，产生硫化氢，可与重金属离子结合生成有色硫化物的均匀沉淀，可与对照标准液同法处理比较。6、氯化物、硫酸盐、铁盐、重金属等（二）葡萄糖注射液的检查特殊杂质：5-羟甲基糠醛(5-HMF)的检查葡萄糖易分解产生5-羟甲基糠醛，其本身是无色的，它可再分解为乙酰丙酸与甲酸或聚合，其聚合物为一种有色物质。葡萄糖遇强热使溶液变黄，至少有一部分颜色是由于葡萄糖的分解产物5-羟甲基糠醛的聚合物作用所致；而且葡萄糖注射液的色泽深浅与5-羟甲基糠醛产生的量成正比。因此，可以用5-羟甲基糠醛的形成速度来检查葡萄糖的分解速度。5-羟甲基糠醛(5-HMF)：对人体横纹肌及内脏有损害引入途径：高温消毒时分解产生检查原理：利用杂质有共轭双烯结构，采用UV-Vis进行检查规定：A284nm≤0.32

2.pH值：pH值3.2-6.53.重金属：≤5ppm4.细菌内毒素、无菌等五、含量测定1、旋光光度法右旋糖苷20氯化钠注射液的含量测定。本品为复方制剂，右旋糖苷20有旋光性，而氯化钠无旋光性，不干扰测定，用旋光度法测定右旋糖苷20的含量。C为每100mL注射液中含右旋糖酐20的质量，g;α为测得的旋光度×稀释倍数五、含量测定2.比色法（1）苯酚-硫酸法利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。己糖在490nm处有最大的吸收，戊糖和糖醛酸在480nm有最大吸收。吸收值与糖含量呈线性关系。甲基化糖，戊糖和多聚糖苯酚（溶解度、氧化---重蒸）吸光度不稳定五、含量测定2.比色法（2）蒽酮-硫酸法糖类与浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生有色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。五、含量测定2.比色法（3）Elson—Morgan法N-甲基葡萄糖胺于碱性介质中与乙酰丙酮进行缩合反应，生成吡咯衍生物（生色原），所产生吡咯衍生物与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液(Ehdich试剂)反应，生成红色缩合物，530nm测吸光度氨基己糖的比色测定五、含量测定2.比色法（4）DNS法还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。五、含量测定2.比色法（5）砷钼酸比色法A.还原糖在碱性条件及有酒石酸钾钠存在下加热，可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子，产生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。水、△Cu2O↓

Fehling试液五、含量测定2.比色法B.氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物——砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖的含量（即被还原的Cu2O量）成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后做标准，就可测得样品还原糖含量。氯化钠（银量法）

精密量取本品20ml，加水30ml，加2％糊精溶液5ml、2.5％硼砂溶液2ml与荧光黄指示液5～8滴，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml的硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于5.844mg的NaCl。滴定法：

葡萄糖氯化钠注射液含量测定（吸附指示剂法）吸附指示剂的变色原理：

化学计量点后，沉淀表面荷电状态发生变化，指示剂在沉淀表面静电吸附导致其结构变化，进而导致颜色变化，指示滴定终点。AgCl︱Cl-+FIn-AgCl︱Ag+FIn-Ag

+黄绿色是一类有机染料荧光黄吸附指示剂吸附指示剂变色原理胶体＋＋＋＋＋＋＋结构发生改变被吸附法扬斯法的变色原理AgClAgNO3用硝酸银测定Cl-含量,荧光黄做指示剂Cl-Cl-Cl-Cl-Ag+Ag+Ag+Ag+Ag+滴定前滴定中滴定终点用硝酸银测定Cl-含量，以荧光黄为指示剂(二)滴定条件沉淀必须具有比较大的比表面积防止胶体凝聚沉降比表面积越大吸附能力越强加入淀粉、糊精等胶体保护剂解决方法AgClAg+Ag+Ag+Ag+滴定必须在中性、弱酸性或弱碱性溶液中进行荧光黄pH<7pH>7pH：7---10pH>10,Ag+→Ag2O滴定法：甘露醇的含量测定（氧化还原滴定法）甘露醇+高碘酸盐+碘化钾游离碘硫代硫酸钠滴定高效液相色谱法：硫酸软骨素的效价测定软骨素是D-葡萄糖醛酸与N-乙酰氨基半乳糖胺重复单位连接组成的酸性黏多糖，硫酸软骨素是软骨素的硫酸酯。生物法：肝素的效价测定第二节脂类药物的分析脂类（lipids）是脂肪、类脂及其衍生物的总称化学组成和结构上有着很大的差异，但具有共同的物理性质－脂溶性。其主要特点是不溶于或微溶于水，易溶于氯仿、乙醚、苯、石油醚等有机溶剂。在体内以游离或结合形式存在于组织细胞中。因为它们参与了生物膜的组成，所以在生物体的生理活动中起着至关重要的作用。

脂类简介三酰甘油蜡磷脂糖脂固醇萜脂肪油１甘油＋３脂肪酸（室温固态）１甘油＋３脂肪酸（室温液态）高级醇＋高级脂肪酸三酰甘油的含磷衍生物三酰甘油的含糖衍生物不含脂肪酸的脂类单纯脂复合脂衍生脂脂类

其中具有特定生理作用、药理效应的脂类物质统称为脂类药物。脂类药物的分类及应用1、不饱和脂肪酸类包括前列腺素、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸及二十碳五烯酸等。

脂类药物的分类及应用2、磷脂类主要包括卵磷脂和脑磷脂，它们是生物膜的主要组分。具有增强神经组织及调节高级神经活动的作用，又是血浆脂肪良好的乳化剂，有促进胆固醇及脂肪运输的作用。卵磷脂也用于治疗肝病，脑磷脂还有止血作用。

脂类药物的分类及应用3、胆酸类胆酸类化合物是人及动物肝脏产生的甾体类化合物，集中于胆囊，排入肠道对肠道脂肪起乳化作用，促进脂肪消化吸收，同时促进肠道正常菌群的繁殖，抑制致病菌生长，保持肠道的正常功能。脂类药物的分类及应用鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸：具有溶石作用，治疗胆石症，还可用于治疗高血压、急性及慢性肝炎、肝硬化及肝中毒等；去氢胆酸、牛磺去氧胆酸脂类药物的分类及应用4、胆固醇类也是甾体类化合物。胆固醇是人工牛黄的原料，是有机体不可缺少的成分，也是机体多种甾体激素及胆酸的合成前体。5、色素类包括胆红素、胆绿素、血红素、原卟啉、血卟啉及其衍生物等。胆红素是抗氧化剂，有清除氧自由基的功能，可用于消炎，也是人工牛黄的重要成分；二、脂类药物的含量测定1.酸碱滴定法熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸因其分子结构中含有羧基，可以以酚酞为指示剂，用氢氧化钠滴定液进行滴定二、脂类药物的含量测定2.重量法谷固醇---固醇的一种。洋地黄皂苷法：洋地黄皂苷在一定条件下与固醇反应，生成沉淀，烘干后即可以重量计算。耗时长、精确度差，偏多。固醇的定性和定量二、脂类药物的含量测定3.分光光度法（1）大豆磷脂（定磷法）样品加硫酸与硝酸加热，加入过氧化氢，形成磷酸（有机磷---无机磷）磷酸与钼酸盐试剂（钼酸铵或钼酸钠）作用生成磷钼酸与亚硫酸钠和对苯二酚（还原剂）作用生成钼蓝（蓝色）620nm测吸光度对照品为磷酸二氢钾二、脂类药物的含量测定3.分光光度法（1）胆红素（Jendrassik-Grof法）胆红素和重氮化试剂反应，生成偶氮染料，在强酸性中呈蓝紫色,在pH2.0～5.5之间呈红色，533nm测吸光度，标准曲线法。二、脂类药物的含量测定3.分光光度法（1）胆红素比吸光系数法：453nm测吸光度，以为1038计算二、脂类药物的含量测定4.气相色谱法EPA、DHA核酸药物的定义：

又称核苷酸类药物。由某些动物、微生物的细胞中提取出的核酸(包括核苷酸和脱氧核苷酸)，或者用人工合成法制备的具有核酸结构(包括核苷酸和脱氧核苷酸结构)同时又具有一定药理作用的物质，称为核酸药物或核酸类生化药物。广义的核酸药物可包括核苷酸药物、核苷药物及含有不同碱基化合物的药物。天然的、类似物、衍生物及其聚合物第三节核酸类药物的分析一类具天然结构的核酸类物质

是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成与降解以及能量代谢的辅酶临床上已广泛使用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎缩等病症的治疗，包括肌苷、辅酶A、GTP、CTP、UTP、ATP、腺苷、辅酶I、辅酶Ⅱ等多数是生物体自身能够合成的物质，具有一定临床功能，毒副作用小，基本都可经微生物发酵或从生物资源中提取。第三节核酸类药物的分析核酸类物质药物一般可分为两大类：另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物。是治疗病毒感染性疾病、肿瘤的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑核苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。第三节核酸类药物的分析核酸药物可分为：

(1)抗病毒剂，代表药物有三氮唑核苷、无环鸟苷，临床上用于抗肝炎病毒、疱疹病毒及其他病毒；单纯疱疹病毒感染(2)抗肿瘤剂，代表药物有用于治疗消化道癌的氟尿嘧啶以及用于治疗各类急性白血病的阿糖胞苷等；(3)干扰素诱导剂，代表药物为聚肌胞，临床上用于抗肝炎病毒、疱疹病毒等；(4)免疫增强剂，主要用于抗病毒及抗肿瘤的辅助治疗；(5)供能剂，用于肝炎、心脏病等多种疾病的辅助治疗。核酸核苷酸磷酸核苷戊糖碱基水解结构和分类理化性质（一）两性性质：磷酸基；碱基（通常：酸性）

pH影响碱基间氢键稳定：DNApH4.0~11.0（二）溶解性：微溶于水，不溶于一般的有机溶剂（三）UV：λmax=260nm蛋白质280nmA260/A280纯DNA≥1.8

纯RNA应达到2.0混有杂蛋白比值降低（四）颜色反应苔黑酚反应:RNA中核糖+浓HCl（浓H2SO4）→糠醛+苔黑酚→深绿色化合物（λmax=670nm）二苯胺反应:DNA中脱氧核糖+浓H2SO4→5-羟基-4-羰基戊醛+二苯胺→蓝色化合物（λmax=595nm）水解后磷酸：磷酸+钼酸→磷钼酸+还原剂（维生素C、氯化亚锡等）→钼蓝（λmax=660nm）Fe3+脱水嘌呤类核苷酸药物分析嘌呤碱（腺嘌呤、鸟嘌呤）戊糖磷酸一、鉴别戊糖鉴别嘌呤鉴别磷酸鉴别特征吸收光谱熔点测定（一）戊糖的鉴别苔黑酚反应（地衣酚反应）---凡核糖均有此反应试剂：浓盐酸，苔黑酚试剂，三氯化铁（催化剂）现象：鲜绿色，670nm二苯胺反应DNA试剂：浓硫酸，二苯胺现象：蓝色，595nm与间苯三酚反应（核苷酸中的戊糖）现象：朱红色（二）嘌呤的鉴别+氨制硝酸银→白色↓→红棕色（遇光）（嘌呤碱基的特殊鉴别反应）

嘌呤碱在弱碱性环境中能与硝酸银作用形成嘌呤银化合物。初为乳白色，稍放久为浅灰褐色絮状物。

（三）磷酸的鉴别有机磷→无机磷+钼酸→磷钼酸+还原剂→钼蓝（四）特征吸收光谱UV：嘌呤环，嘧啶环IR（五）熔点测定二、检查一般检查酸度，水分，无机盐，有机物，溶液的颜色和澄清度蛋白质检查磺基水杨酸溶液有关物质纸色谱，薄层色谱，电泳，荧光检查三、含量测定紫外-可见分光光度法现在国家已经批准的嘌呤类核苷酸药物一般都用此法测定含量HPLC四、实例分析肌苷ATP（一）肌苷的质量分析1.结构：C10H12N4O5268.23本品为9β-D-核糖次黄嘌呤。按干燥品计算，含C10H12N4O5应为98.0～102.0％。2.性状：本品为白色结晶性粉末；无臭，味微苦。本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，在稀盐酸和氢氧化钠溶液中易溶。3.鉴别取0.01％供试品溶液适量,加等体积的3,5-二羟基甲苯溶液(取3，5-二羟基甲苯与三氯化铁各0.1g，加盐酸使成100ml)，混匀，在水浴中加热约10分钟，即显绿色。---苔黑酚反应取本品1％水溶液，加氨制硝酸银试液数滴，即产生白色胶状沉淀。---嘌呤碱基

取含量测定项下的溶液,照分光光度法测定，在248nm的波长处有最大吸收，在222nm的波长处有最小吸收。色谱图IR4.检查

溶液的澄清度与颜色（溶液的透光率）取本品0.5g，加水50ml使溶解，照分光光度法在430nm的波长处测定透光率，不得低于98.0％(供注射用)。干燥失重取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过1.0炽灼残渣不得过0.1％(供注射用),或不得过0.2％(供口服用重金属取本品1.0g，依法检查含重金属不得过百万分之十。次黄嘌呤

①精密称取本品0.5g，置50ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度，摇匀，照纸色谱法试验，吸取上述溶10μl，点于3×25cm色谱滤纸上，照上行法，以水为展开剂，展开约20cm处，取出晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，不得出现杂质斑点。

②HPLC5.含量测定

1）UV法：取本品，精密称定，加水制成每1ml中约含10μg的溶液，照分光光度法在248nm的波长处测定吸收度，按C10H12N4O5的吸收系数（E1％1cm）为460计算。2）HPLC6.作用与用途辅酶类药。有改善机体代谢作用。用于各种类型肝脏疾患、心脏疾患、白细胞减少症、血小板减少症、中心视网膜炎、视神经萎缩等。7.用法与用量口服，一次0.2～0.6g一日0.6～1.8g8.贮藏遮光，密闭保存。9.制剂(1)肌苷口服溶液(2)肌苷片(3)肌苷注射液(4)肌苷胶囊(5)肌苷颗粒剂（二）三磷酸腺苷二钠（ATP）的质量分析

拼音名：Sanlinsuanxiangan‘erna

英文名：AdenosineDisodiumTriphosphate

C10H14N5Na2O13P3551.151.结构：本品为腺嘌呤核苷-5’-三磷酸酯二钠盐三水化合物。按干燥品计算，含C10H14N5Na2O13P3不得少于95.0％。

2.性状：本品为白色或类白色粉末或结晶块状物；无臭，味咸；有引湿性。本品在水中易溶，在乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶。3.鉴别（1）取本品20mg,加稀硝酸2ml溶解后，加钼酸铵试液1ml，加热，放冷，即析出黄色沉淀。---磷酸盐（2）取本品约10mg，加盐酸溶液(1→2)5ml溶解后，加间苯三酚10mg，混匀，置水浴中加热约1分钟，即显玫瑰红色。--戊糖（3）苔黑酚反应—戊糖（3）UV（4）IR（5）本品的水溶液显钠盐的鉴别反应4.检查酸度溶液的澄清度与颜色蛋白质取本品20mg，加水2ml溶解后，滴加30％磺基水杨酸溶液0.5ml，不得发生浑浊。有关物质水分氯化物铁盐重金属热原

5.含量测定

（1）总核苷酸：UV（2）三磷酸腺苷二钠的重量比：HPLC（3）色谱条件与系统适用性试验（4）测定法6.作用与用途

辅酶类药。用于进行性肌萎缩、脑溢血后遗症、心功