园林植物遗传育种-第十二章

园林植物遗传育种学主讲：刘娟(林学院)Email:园林植物遗传育种学绪论第一章

遗传的细胞学基础第二章遗传的基本规律第三章数量性状的遗传第四章细胞质遗传第五章遗传物质的改变第六章群体的遗传和进化第七章园林植物性状遗传第八章育种资源第九章引种驯化第十章选择、杂交、倍性育种第十一章诱变育种第十二章基因工程第十二章基因工程一、基因工程的概念与意义二、基因工程的基本概念三、基因工程的两个必要的工具酶四、基因工程的基本步骤五、植物基因工程六、基因工程的安全性一、基因工程的概念与意义概念

按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组技术和DNA转移技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在短时间内趣于完善，以创造出新的生物类型的技术体系，亦即基因工程。2.意义蓝玫瑰一、基因工程的概念与意义二、基因工程的基本概念1.转化（Transformation)：指将外源DNA导入受体细胞的过程。2.复制子（Replicon)：具有一个复制起点的DNA分子称为一个复制子。3.载体（Vector）：能与外源DNA连接并实现转化的复制子。4.重组子（binant）：连接了外源DNA分子的复制子。三、基因工程的两个必要的工具酶⒈限制性核酸内切酶（限制性内切酶、限制酶）

这一类酶能在DNA上核苷酸的特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。例如：EcoRI、HpaI——“分子剪刀”⒉DNA连接酶——浆糊能把DNA的两个片段重新连接起来。例如：T4DNA连接酶三、基因工程的两个必要的工具酶四、基因工程的基本步骤目的基因的获取基因载体的选择与构建目的基因与载体的拼接重组子导入受体分子外源基因的表达和产物的分离重组子的检测⒈目的基因的获得

所谓目的基因是指符合人们要求的DNA片段。⑴从基因所在生物直接取得①用限制酶剪切供体DNA②用机械的方法，如超声波⑵

mRNA逆转录出cDNA（反转录DNA）DNA聚合酶mRNADNA（单链）DNA（双链即cDNA）逆转录酶四、基因工程的基本步骤⑶化学合成法多肽链的氨基酸顺序mRNA的碱基排列顺序相应的基因结构化学合成目的基因四、基因工程的基本步骤⒉目的基因与载体连接成重组DNA

载体一般用经过改造的质粒（细菌细胞中染色体以外的比较小的环状DNA分子，不是细菌生存所必需的，却可在细菌内复制，稳定遗传）或温和型的病毒DNA。注意：一定要用同一种限制酶处理供体DNA和载体。四、基因工程的基本步骤⒊目的基因引入受体细胞

带有外源DNA片段的重组体分子在体外构成之后，需要导入适当的寄主细胞进行繁殖，才能获得大量纯一的重组体DNA分子。这一过程通常称为基因的扩增。四、基因工程的基本步骤⑴方式①转化：受体细胞捕获并表达重组的质粒载体DNA。转染：受体细胞捕获并表达重组的噬菌体DNA。②转导

将重组噬菌体DNA进行体外包装形成噬菌体颗粒，再使之侵染细菌。四、基因工程的基本步骤②真核表达系统

猴肾细胞、酵母菌⑵受体细胞①原核表达系统

大肠杆菌、枯草杆菌

四、基因工程的基本步骤

将某生物的DNA片段与载体连接，转移到适当的受体细胞中，通过细胞增殖得到这一片段的无性繁殖系或克隆；如果所制备的克隆数多到可把该生物的全部基因包含在内时，这一组克隆就成为该生物的基因文库。基因文库的建立，不仅有利于随时钓取目的基因，进行表达，还有利于保存生物界各种有益基因，是保存宝贵的生物自然资源的理想方法。⑶基因文库四、基因工程的基本步骤⒋克隆基因的分离与鉴定常用方法：分子杂交依据：碱基互补配对原则①合成核酸探针（与所需基因互补的核苷酸短链，并用同位素标记）②升高温度或改变pH使DNA变性(双链解旋)③分子杂交如果基因文库中的一个DNA片段能和探针结合形成双链，这一片段即含有所需基因。步骤：四、基因工程的基本步骤⒌目的基因的表达

即目的基因在受体细胞中准确的转录和翻译。四、基因工程的基本步骤五、植物基因工程

植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起来的现代生物技术。（一）植物基因工程基本环节植物基因工程的载体植物基因工程的报告基因基因转化的受体系统外源DNA导入植物细胞的方法转化细胞的培养和植株的再生外源基因在转基因植物中的表达转基因植物的鉴定技术转基因植物的释放五、植物基因工程

(二)方法载体介导的转化方法DNA直接导入法种质系统法1.外源DNA导入植物细胞的方法五、植物基因工程2.转基因操作的受体系统高频再生体系的建立

愈伤组织再生系统直接分化再生系统原生质体再生系统胚状体再生系统生殖细胞再生系统抗生素敏感实验

抑制细菌生长杀死非转化细胞农杆菌敏感实验五、植物基因工程3.转化细胞的培养和转基因植株的再生恢复生长筛选培养植株再生五、植物基因工程4.转基因植物的鉴定遗传鉴定表达鉴定表型分析鉴定利用报告基因Northern杂交Western杂交

直接鉴定DNA分子是否整合到基因组上。

1）扩增目的片段；

2）杂交信号鉴定。（Southern杂交）五、植物基因工程鉴定步骤：筛选鉴定（利用质粒上的选择标记）报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因）遗传鉴定生长试验

DNA鉴定-southernRNA鉴定-northern蛋白质鉴定-western五、植物基因工程六、基因工程的安全性（一）安全问题的考虑

工程菌株的处理转基因植物的释放转基因产品的安全1.转基因作物本身成为杂草；2.转基因作物使其亲缘野生种成为杂草或超级杂草；