生物工艺原理课程设计

-PAGE11-课程设计报告课程名称：生物工艺原理题目：假丝酵母恒化培养生物反应器设计学院：生命科学与食品工程学院专业班级：生物工程101班学号：5602210032学生姓名：辛鑫指导教师：段学辉2012

目录一、任务要求 41.1设计目的 41.2设计任务 41.3设计要求 4二、设计原理 52.1恒化培养生物反应器的概念及原理 52.2恒化培养的优越性 52.3恒化培养反应器的应用 5三、具体设计 63.1基本要求 63.3设备组成 73.4具体操作 73.5主要工艺参数 9四、总结 104.1设备总结 104.2心得体会 10五、参考资料 11

一、任务要求1.1设计目的假丝酵母(Candida)细胞圆形、卵形或长形。多边出芽繁殖。能形成假菌丝。在麦芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色，平滑，有光泽，边缘整齐或菌丝状。液体培养的能形成浮膜。能发酵葡萄糖、蔗糖、棉子糖。不能发酵麦芽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖。不分解脂肪。能同化硝酸盐。假丝酵母的蛋白质和维生素B含量都比啤酒酵母高。它能以尿素和硝酸盐作氮源，在培养基中不加其它因子即可生长。它能利用造纸工业中的亚硫酸废液，也能利用糖蜜、马铃薯淀粉和木材水解液等。因此能利用假丝酵母来处理工业和农副产品加工业的废弃物，生产可食用的蛋白质，在综合利用中很有价值。此属中有的菌能转化50％的糖成为甘油。假丝酵母也是脂肪酶的生产菌种，在工业上可用于绢纺原料的脱脂单细胞蛋白（SCP）是从酵母或细菌等微生物菌体中获取的蛋白质。微生物细胞中含有丰富的蛋白质，例如酵母菌蛋白质含量占细胞干物质的45%～55%；细菌蛋白质占干物质的60%～80%；霉菌丝体蛋白质占干物质的30%～50%；单细胞藻类如小球藻等蛋白质占干物质的55%～60%，而作物中含蛋白质最高的是大豆，其蛋白质含量也不过是35%～40%。单细胞蛋白的氨基酸组成不亚于动物蛋白质，如酵母菌体蛋白，其营养十分丰富，人体必需的8种氨基酸，除蛋氨酸外，它具备7种，故有“人造肉”之称。一般成人每天吃干酵母10～15g，蛋白质的需要量就足够了。微生物细胞中除含有蛋白质外，还含有丰富的碳水化合物以及脂类、维生素、矿物质，因此单细胞蛋白营养价值很高。1.2设计任务自主设计一个假丝酵母恒化培养生物反应器。根据实际情况和经济方面的考虑，最终选择了假丝酵母作为我们生产菌种，玉米淀粉渣作为菌种发酵所用的材料。1.3设计要求自主设计，说明恒化器的加料系统，放料系统，发酵罐体积等。在设计中了解连续培养在实际生产中的重要性，发现恒化器培养的优越性，并理解恒化器的概念，掌握恒化器的工作原理。通过设计恒化培养生物反应器了解培养过程中微生物的生长繁殖过程，利用实验中学到的知识，培养理论与实际结合的能力。二、设计原理2.1恒化培养生物反应器的概念及原理生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，它是一种生物功能模拟机，如发酵罐、固定化酶或固定化细胞反应器等。在酒类、医药生产、有机污染物降解方面有重要应用。恒化培养反应器通过控制某一营养物浓度（如碳源、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行连续生长繁殖。当多种微生物在同一反应器中混合连续培养时，各种微生物竞争利用限制性基质，从而具有优势的微生物得以保留不具优势的微生物则被淘汰。当某一种微生物在连续培养是发生变异，则原出发菌与变异菌之间发生竞争。2.2恒化培养的优越性分批培养所培养的细胞，通常是经过停止期、对数期、静止期的生长过程。在培养过程中，常有因培养基成分、细胞密度等发生变化，使细胞环境不能保持一定的欠缺，但所使用装置和方法均较连续培养法简便，所以被广泛使用。恒化器培养微生物不经过“四个阶段”，菌群基本是在对数生长期旺盛生长，产量很大。大部分培育菌体基本使用发酵罐分级发酵，从种子罐到生产罐，逐级扩大，这种方法存在占用设备量大，每一级都要经过接种、培养和放罐的过程，操作复杂，易感染杂菌、老化菌多，变异性达等问题，这个设备能够连续培养微生物，且设备占用少，操作不复杂。2.3恒化培养反应器的应用微生物的连续培养是相对于分批培养而言的。连续培养是指在深入研究分批培养中生长曲线形成的内在机制的基础上，开放培养系统，不断补充营养液、解除抑制因子、优化生长代谢环境的培养方式。由于培养系统的相对开放性，因此，连续培养也称为开放培养。连续培养的显著特点与优势是，它可以根据研究者的目的，在一定程度上，人为控制典型生长曲线中的某个时期，使之缩短或延长时间，使某个时期的细胞加速或降低代谢速率，从而大大提高培养过程的人为可控性和效率。连续培养模式应用于发酵工业则称之为连续发酵。恒化连续培养往往控制微生物在低于最高生长速率的条件下生长繁殖。恒化连续培养在研究微生物利用某种底物进行代谢的规律方面被广泛采用。因此，它是微生物营养、生长、繁殖、代谢和基表达与调控等基础与应用基础研究的重要技术手段。三、具体设计这次设计通过结合以前学过的发酵，连续培养，恒化器，培养基的配置原则等理论知识，结合生物实验中学到的操作等，参考一定的书籍以及查询网络设计出来的。3.1基本要求（1）保证系统内的培养基和培养物不受污染；（2）新的培养基以可调控的速度逐滴加入培养罐，同时有相应数量的老培养液排出，保持培养物总量恒定；（3）培养罐内培养物应充分搅拌，保持均一，使流入的新培养基在瞬间即可均匀的分布到整个培养物中；（4）以某一营养成分为生长限制底物的液体培养基；（5）根据需要对温度、通气程度、培养物PH的监测和调节设相应的附加装置。3.2设备图3.3设备组成（1）主体结构：发酵罐主要由内外两层罐体构成。其中，外筒工作时加入水，下接有加热管和热电偶，可以把水加热并保持到预期的温度；内筒工作时从上加入培养基和菌种。利用内层筒体进行传热虽然会降低热效率，但这样既可以防止培养基因达到沸点而沸腾起来，又可防止加热管直接加热到菌丝而造成菌体死亡。（2）补料系统：补料储液罐，蠕动泵（3）出料及取样系统：封口碱液罐，废液池，止动阀，玻璃三通（4）酸碱调控系统：酸碱储液罐，PH调控装置，玻璃三通（5）进气导入管，橡皮塞，导管等3.4具体操作A口三通中一个连接口与酸碱PH调控系统的酸碱储蓄罐相通，由酸碱PH调控系统的PH反馈蠕动泵和PH调控装置在线调控，另一个连接口与补料系统的补料储液瓶连接，由补料系统设置的蠕动泵控制，B孔中的两个连接口分别与出料及取样系统设置的废弃池和封口碱液罐相通。补料系统：补料系统设置的蠕动泵与A孔三通中的一个连接口连接，并与补料储液瓶相通。出料系统：出料及取样系统包括取样管，该取样管连接B孔三通上，前后口由止动阀夹住。培养液A加料至反应池中，然后将培养好的2%-10%接种量的第二代种子液转移到反应池，装液量100-250L，30-40℃间接发酵6-10h至对数期后，开始由补料系统中的蠕动泵以0.01~0.5L/h流加补料新鲜培养基B，同时二氧化碳气体以0.1~装液量在100~250L之间，气体经进气管至反应液底部能带动反应液的翻滚，从而减少了额外的搅拌系统，使得整个装置更加简单可行。培养液B中限制单一碳源葡萄糖的添加量，使其始终作为生长限制因子，以达到控制培养液流速保持不变的目的，并使微生物始终在低于其最高生长速率下连续生长繁殖，补料新鲜培养基B中其他成分都保持过量。连续培养过程中，每10-15h取样检测发酵液的各项参数，并每5-14天后无菌取样，稀释适当倍数后涂布到培养基C平板，厌氧培养1-5天，判断优良菌种。其中流加补料新鲜培养基B由反应液体系中生长限制因子的浓度和菌体生物量的变化综合考虑，不断调试稀释速率的大小，直至反应体系达到拟稳定状态，拟稳定状态定义为：每10-15h取样检测发酵液的各项参数，连续三次取样参数基本一致时认为反应体系达到拟稳定状态。为了易于判断目的突变菌株的出现，生长限制因子并不是让其被完全消耗掉，而是让其有所剩余并维持在一个较低的范围。在拟稳定连续培养中，当生长限制因子浓度下降说明菌体生长速率加快，暗示目的突变菌株有可能出现。通过菌株生长速度的快慢，菌落形态的大小，以及产生变色圈的大小来判断是否为优良菌株，挑取优良菌株转接至发酵培养液B，再培养检测。监测中的取样，是将取样管的管口伸入封口碱液罐的液面以下，取样时夹住出料口管，打开取样口管，将反应池整体向取样口方向倾斜一角度，则有一定发酵也被气体压入取样管。由此每次取样都是来自反应池的及时样液且取样体积基本一定，取样口不存在被堵的问题，并解决了需要事先放液的麻烦进而保证了反应体积的恒定。长时间的连续培养需要频繁的更换补料瓶，常规方法是在酒精灯火焰上方有效区域中更换补料瓶，但是这在实际操作中并不容易且存在很大偶然性，一不小心就会染上杂菌，而此系统是在20%-50%的氢氧化钠强碱溶液中操纵，染菌几率大大减少。3.5主要工艺参数（1）培养基A豆粉40g/L,淀粉15g/,豆油5mL/L,K2HPO4g/L,MgsO4·7H2O1g/L,Tween-800.1％,酵母膏5g/L，初始pH值为6.0（2）培养基B葡萄糖10g/L,乙酸钠2.72g/L,NaCL2g/L,CaCL20.4g/L,MgCL20.4g/L,Na2HPO40.62g/L,NaH2PO43.2g/L,K2HPO46g/L,酵母膏，NH4HCO34.8g/L,C4H4O4Na2100，CH3COONa·3H2O80，PH7.0（3）其他装液量100L,二代种子液接种量10%，间歇发酵10h后，流加补料新鲜培养基，种子培养基、间歇培养基采用培养基A，补料培养基采用培养基B，PH7.0，其中减少有机氮源酵母膏的含量直至0，同时相应提高无机氮源NH4HCO3浓度至8g/L,充无菌纯二氧化碳，流速0.5L/min，温度30℃,50%NaOH在线调控PH6.8①稀释速率稀释率在0.01-0.223/h之间按实际情况调节，残糖减少且生物量OD660相应增大则提高稀释率，残糖增多且OD660减少则降低稀释率，直至达到拟稳态平衡。平衡判断标准：每隔15h取样一次，当连续三次取样葡萄糖和OD660数值基本不变时可认为达到拟稳态平衡。当培养基B中有机氮源酵母膏的量减少到0时主要氮源为无机氮源后，菌株仍生长良好则认为生产能够利用无机氮源的突变株，每14天无菌取样稀释适当倍数后涂布培养，从中挑取生长旺盛的接种于B培养基。②发酵罐体积根据设计要求可知：恒化器中的SCP含水量为80%；细胞的比生长速率μ=0.45；发酵罐中的一天可生产的SCP湿重＝10kg/(1-0.8)＝50kg故料液的流速F＝50kg/24h＝2.08kg/h在稳态条件下，dX/dt＝0,即uX＝DX由于稀释率D＝F/V，那么uX·V＝F＝2.08kg/h又因为细胞浓度要保持在20—50g/L，取细胞浓度为30g则Vp·Cc＝2.08/0.45(其中Vp是发酵液的体积，Cc是细胞浓度)综合以上数据求得Vp＝154.1L设定发酵液只占用发酵罐的体积的3/4，则发酵罐的体积为V＝Vp÷0.75＝205.5规定发酵罐的体积为V实际＝200L③生产能力现每天产SCP2t，假丝酵母发酵周期为54h（包括发酵罐清洗、灭菌、进出物料等辅助操作时间），则每天需糖化液体积为V糖。每天产SCP2t，每吨SCP需糖液31L，则V糖=31L四、总结4.1设备总结连续培养延长对数期是有限的，是相对的。如在发酵生产中，在细胞群体生长进入稳定期，产物开始大量合成时进行补料，适当增加发酵液中合成产物的底物量和维持细胞生存所需要的低微浓度的营养物，使细胞在非生长繁殖状态下合成产物的持续时间延长，从而达到提高单位发酵液中产物总量（效价）之目的。在这种细胞生长繁殖与目的产物合成处于阶段分明的不同时期工艺技术，要大幅度地延长目的产物合成期是难以做到的。因为，随着对细胞自身具有一定毒害作用的产物在细胞内外环境中浓度的提高，其它对细胞生存不利的代谢产物在环境中的量也在同时增加，会制约细胞长时间维持产物合成的高效率。通过补料，适当增加营养，可以延缓了细胞衰老与自溶崩溃，但是，应该指出细胞